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icenoreen銅蟲(chóng) (初入文壇)
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關(guān)于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)transwell使用的一些操作問(wèn)題 已有3人參與
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我最近要做某種蛋白的趨化性試驗(yàn)，由于之前沒(méi)有做過(guò)，所以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上查了不少資料，也參考了小木蟲(chóng)上的挺多經(jīng)驗(yàn)，自己做了個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)備這兩天做，但還有挺多細(xì)節(jié)不太明確，所以上來(lái)發(fā)一下我的實(shí)驗(yàn)步驟和設(shè)計(jì)，請(qǐng)教大家一些細(xì)節(jié)上的問(wèn)題，也和做過(guò)的網(wǎng)友們交流一下。 我買的是Corning#3422 transwell，用的細(xì)胞是SD大白鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞。 根據(jù)查得的資料（包括transwell說(shuō)明書(shū)，corning官網(wǎng)的指南，網(wǎng)上下的操作說(shuō)明以及論壇上的交流總結(jié)）我把實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單總結(jié)如下： 1. MSC鋪滿培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)，換無(wú)血清培基，饑餓處理24h。【此處培基需要加0.5%BSA嗎？】 2. 胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清培基（含0.5%BSA）中止消化并稀釋得細(xì)胞懸液（10萬(wàn)/ml）。 3. 100ul細(xì)胞懸液接種至上室，600ul 10%FBS的培基加入下室�！具@個(gè)順序?qū)�？還是應(yīng)該先加下室？還是無(wú)所謂？】【干細(xì)胞的接種量多少比較合適？我這里是按照一般的24孔板用1萬(wàn)/孔可以嗎？還有一般需要至少幾個(gè)平行孔？transwell孔板比較貴，在保證盡量準(zhǔn)確的情況下最少設(shè)2個(gè)平行樣行嗎？】 4. 孵育一定時(shí)間。【我的干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶里時(shí)一般4小時(shí)左右就能貼壁，8小時(shí)基本完全鋪展，那么做遷移測(cè)試的時(shí)候應(yīng)該放多長(zhǎng)時(shí)間呢？】 5. 計(jì)數(shù)。 (1) 用棉簽擦去上室細(xì)胞�！具@里我很不明確啊，我下載的官網(wǎng)說(shuō)明只說(shuō)“除去上室細(xì)胞”，網(wǎng)上網(wǎng)友大多都說(shuō)用棉簽擦掉，用的是一般的那種醫(yī)用棉簽？具體怎么擦？這樣擦對(duì)下室細(xì)胞沒(méi)影響么？】 (2) 染色用顯微鏡拍照和計(jì)數(shù)或MTT法測(cè)OD值計(jì)數(shù)。【是不是細(xì)胞比較多的時(shí)候測(cè)OD值更準(zhǔn)確？如果我又想拍照又想測(cè)得比較準(zhǔn)又不想設(shè)置太多孔平行樣是不是可以用結(jié)晶紫染色后洗脫測(cè)一次OD值然后再次染色拍照？】 我的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 預(yù)實(shí)驗(yàn)：以不同接種數(shù)量和不同孵育時(shí)間試驗(yàn)找到最優(yōu)條件。 實(shí)驗(yàn)：無(wú)血清培基（含0.5%BSA）中加入不同濃度待測(cè)蛋白作為下室培基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)該蛋白的dose-dependence，無(wú)血清培基（含0.5%BSA）作為空白對(duì)照，10%FBS培基作為正對(duì)照。 以上是我的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，方括號(hào)里的是我的一些問(wèn)題想請(qǐng)教大家......因?yàn)槲疫�沒(méi)開(kāi)始做所以問(wèn)題有點(diǎn)多......有做過(guò)或者準(zhǔn)備做遷移實(shí)驗(yàn)的人一起來(lái)交流一下吧！ P.S. 我本身是材料專業(yè)做生物材料的，跨學(xué)科很多生物的東西都還在學(xué)，如果有的問(wèn)題比較低級(jí)的話還請(qǐng)大家見(jiàn)諒和耐心賜教呢  [ Last edited by icenoreen on 2013-12-30 at 19:44 ] |
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 細(xì)胞科學(xué) |
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6樓2014-03-17 15:12:21
john-yong
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11樓2014-12-29 11:47:56
daibingling
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
icenoreen: 金幣+4, ★有幫助, 非常感謝... 很期待進(jìn)一步交流... 2014-01-13 21:34:58
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icenoreen: 金幣+4, ★有幫助, 非常感謝... 很期待進(jìn)一步交流... 2014-01-13 21:34:58
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1.此處培基不需要加0.5%BSA。 2.我一般是先加上室，再加下室，不過(guò)我覺(jué)得這個(gè)無(wú)所謂。 3.每孔一萬(wàn)個(gè)細(xì)胞是不是有點(diǎn)少啊，我用的腫瘤細(xì)胞都是十的五次方。平行孔，我一般設(shè)置兩組。 4.做遷移的時(shí)間就看你自己怎么設(shè)置了，24,48小時(shí)都可以，或者做的再細(xì)一些也行。 5.上室細(xì)胞就用醫(yī)用棉簽輕輕轉(zhuǎn)著擦掉就可以了，不會(huì)影響遷移過(guò)去的細(xì)胞。 |
2樓2013-12-31 11:14:20
icenoreen
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3樓2013-12-31 11:43:09
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自己頂上來(lái)，順便再問(wèn)一個(gè)問(wèn)題…… 我做了一次遷移實(shí)驗(yàn)，用不同濃度百分比血清的培基來(lái)做的預(yù)實(shí)驗(yàn)，遷移細(xì)胞數(shù)量梯度倒是挺明顯的，但染色以后顯微鏡下看發(fā)現(xiàn)細(xì)胞都在膜的邊緣一圈，中間一個(gè)細(xì)胞也沒(méi)有……不知道是為什么啊~ 我在想是不是我用棉簽擦上層細(xì)胞的時(shí)候太用力所以把中間細(xì)胞都抖下去了？ 還是往上室加細(xì)胞懸液了以后細(xì)胞傾向于往邊上貼壁？ 另外，誰(shuí)能告訴我一下用棉簽擦去上層細(xì)胞的具體細(xì)節(jié)啊？網(wǎng)上完全搜不到關(guān)于這個(gè)的詳細(xì)說(shuō)明，只有一句“用棉簽擦”，大家都覺(jué)得很好擦嗎？為什么我覺(jué)得很難擦啊，transwell上室就那么小，棉簽頭基本上剛好伸進(jìn)去，很難確保整個(gè)都擦到了呀...... 求教擦上室細(xì)胞的具體方法�。ㄓ妹藓灮蛘哂脛e的什么都可以，只要能除去上室細(xì)胞~） 再次不勝感激！ 回復(fù)的人好少好少...求交流呀>< |
4樓2014-01-02 20:26:38
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9樓2014-03-24 22:32:57
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10樓2014-09-26 20:35:39
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