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icenoreen銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于細胞遷移實驗transwell使用的一些操作問題 已有3人參與
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我最近要做某種蛋白的趨化性試驗，由于之前沒有做過，所以在實驗設(shè)計上查了不少資料，也參考了小木蟲上的挺多經(jīng)驗，自己做了個實驗設(shè)計，準(zhǔn)備這兩天做，但還有挺多細節(jié)不太明確，所以上來發(fā)一下我的實驗步驟和設(shè)計，請教大家一些細節(jié)上的問題，也和做過的網(wǎng)友們交流一下。 我買的是Corning#3422 transwell，用的細胞是SD大白鼠的間充質(zhì)干細胞。 根據(jù)查得的資料（包括transwell說明書，corning官網(wǎng)的指南，網(wǎng)上下的操作說明以及論壇上的交流總結(jié)）我把實驗步驟簡單總結(jié)如下： 1. MSC鋪滿培養(yǎng)瓶底80%左右時，換無血清培基，饑餓處理24h。【此處培基需要加0.5%BSA嗎？】 2. 胰酶消化細胞，用無血清培基（含0.5%BSA）中止消化并稀釋得細胞懸液（10萬/ml）。 3. 100ul細胞懸液接種至上室，600ul 10%FBS的培基加入下室�！具@個順序?qū)幔窟�是應(yīng)該先加下室？還是無所謂？】【干細胞的接種量多少比較合適？我這里是按照一般的24孔板用1萬/孔可以嗎？還有一般需要至少幾個平行孔？transwell孔板比較貴，在保證盡量準(zhǔn)確的情況下最少設(shè)2個平行樣行嗎？】 4. 孵育一定時間�！疚业母杉毎谂囵B(yǎng)瓶里時一般4小時左右就能貼壁，8小時基本完全鋪展，那么做遷移測試的時候應(yīng)該放多長時間呢？】 5. 計數(shù)。 (1) 用棉簽擦去上室細胞�！具@里我很不明確啊，我下載的官網(wǎng)說明只說“除去上室細胞”，網(wǎng)上網(wǎng)友大多都說用棉簽擦掉，用的是一般的那種醫(yī)用棉簽？具體怎么擦？這樣擦對下室細胞沒影響么？】 (2) 染色用顯微鏡拍照和計數(shù)或MTT法測OD值計數(shù)。【是不是細胞比較多的時候測OD值更準(zhǔn)確？如果我又想拍照又想測得比較準(zhǔn)又不想設(shè)置太多孔平行樣是不是可以用結(jié)晶紫染色后洗脫測一次OD值然后再次染色拍照？】 我的實驗設(shè)計： 預(yù)實驗：以不同接種數(shù)量和不同孵育時間試驗找到最優(yōu)條件。 實驗：無血清培基（含0.5%BSA）中加入不同濃度待測蛋白作為下室培基進行實驗，測該蛋白的dose-dependence，無血清培基（含0.5%BSA）作為空白對照，10%FBS培基作為正對照。 以上是我的實驗設(shè)計，方括號里的是我的一些問題想請教大家......因為我還沒開始做所以問題有點多......有做過或者準(zhǔn)備做遷移實驗的人一起來交流一下吧！ P.S. 我本身是材料專業(yè)做生物材料的，跨學(xué)科很多生物的東西都還在學(xué)，如果有的問題比較低級的話還請大家見諒和耐心賜教呢  [ Last edited by icenoreen on 2013-12-30 at 19:44 ] |
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icenoreen
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9樓2014-03-24 22:32:57
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1.此處培基不需要加0.5%BSA。 2.我一般是先加上室，再加下室，不過我覺得這個無所謂。 3.每孔一萬個細胞是不是有點少啊，我用的腫瘤細胞都是十的五次方。平行孔，我一般設(shè)置兩組。 4.做遷移的時間就看你自己怎么設(shè)置了，24,48小時都可以，或者做的再細一些也行。 5.上室細胞就用醫(yī)用棉簽輕輕轉(zhuǎn)著擦掉就可以了，不會影響遷移過去的細胞。 |
2樓2013-12-31 11:14:20
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3樓2013-12-31 11:43:09
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自己頂上來，順便再問一個問題…… 我做了一次遷移實驗，用不同濃度百分比血清的培基來做的預(yù)實驗，遷移細胞數(shù)量梯度倒是挺明顯的，但染色以后顯微鏡下看發(fā)現(xiàn)細胞都在膜的邊緣一圈，中間一個細胞也沒有……不知道是為什么啊~ 我在想是不是我用棉簽擦上層細胞的時候太用力所以把中間細胞都抖下去了？ 還是往上室加細胞懸液了以后細胞傾向于往邊上貼壁？ 另外，誰能告訴我一下用棉簽擦去上層細胞的具體細節(jié)�。烤W(wǎng)上完全搜不到關(guān)于這個的詳細說明，只有一句“用棉簽擦”，大家都覺得很好擦嗎？為什么我覺得很難擦啊，transwell上室就那么小，棉簽頭基本上剛好伸進去，很難確保整個都擦到了呀...... 求教擦上室細胞的具體方法！（用棉簽或者用別的什么都可以，只要能除去上室細胞~） 再次不勝感激！ 回復(fù)的人好少好少...求交流呀>< |
4樓2014-01-02 20:26:38
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