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lingbi銀蟲 (正式寫手)
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引物設(shè)計實例分析 已有1人參與
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發(fā)現(xiàn)一個很好的引物設(shè)計的PPT，傳上來跟大家分析一下，同時我有幾個點沒看懂，也想請明白的朋友給指點一下。 目的： 將plasmid 2上GFP基因擴下來連到plasmid 1 上 GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 問題一： Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. 引物2 TTA為什么去掉？不需要終止密碼子嗎？ 問題二加酶切位點后： Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 添加酶切位點后為什么在primer1的酶切位點后面加個 T 呢？是為了三個一組ATG剛好一組嗎？為什么加的是T不是別的？ Primer2: 5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC為何在primer2的酶切位點后加CT？這有何講究？ 問題敘述的也許不清楚，請大俠 參看PPT給解釋一下吧。謝謝 |
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2014-01-03 15:21:18, 215 K
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1. TAA是終止密碼子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表達標簽或者其他基因。用后面基因的終止密碼子就可以了。 2. 在酶切位點與ATG之間加堿基一般是考慮移碼的問題。情況大概是由于在這個基因前面有其他基因或者標簽需要融合表達。在基因的反向引物的酶切位點之后加堿基也是考慮移碼是問題，大概基因后面有表達標簽或者融合蛋白。具體是什么堿基問題不是很大。主要考慮不能形成終止密碼子。我想在這里用T的原因可能是調(diào)整引物的GC含量。 |
4樓2014-01-05 11:01:56
lingbi
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3樓2014-01-05 09:07:54
5樓2014-01-05 22:03:30
lingbi
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送紅花一朵 |
解釋非常詳細，謝謝你。我還有問題 1、是Tm值、GC含量，PPT中看是未加酶切位點和保護堿基時就計算的，補加堿基防止移碼時補什么看GC含量，這是的GC含量是要計算一下含酶切位點什么的嗎？ 2、酶切位點、保護堿基中GC含量高，那么實驗中退火溫度（不含酶切位點算的Tm）是不是5個循環(huán)后提高溫度？提高多少合適？ 3、Primer1: 5’ cgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 引物設(shè)計中說3‘端以A結(jié)尾不好，是不是直接去掉這個就行？出于簡并性考慮，引物3’端不要終止于密碼子第三位，可是從哪個地方開始數(shù)呢，這個引物擴增出的片段插入BamHI位點，是從GGATTC開始數(shù)嗎？ |
6樓2014-01-06 09:58:49
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