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lingbi銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析 已有1人參與
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發(fā)現(xiàn)一個(gè)很好的引物設(shè)計(jì)的PPT，傳上來跟大家分析一下，同時(shí)我有幾個(gè)點(diǎn)沒看懂，也想請明白的朋友給指點(diǎn)一下。 目的： 將plasmid 2上GFP基因擴(kuò)下來連到plasmid 1 上 GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 問題一： Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. 引物2 TTA為什么去掉？不需要終止密碼子嗎？ 問題二加酶切位點(diǎn)后： Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 添加酶切位點(diǎn)后為什么在primer1的酶切位點(diǎn)后面加個(gè) T 呢？是為了三個(gè)一組ATG剛好一組嗎？為什么加的是T不是別的？ Primer2: 5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC為何在primer2的酶切位點(diǎn)后加CT？這有何講究？ 問題敘述的也許不清楚，請大俠 參看PPT給解釋一下吧。謝謝 |
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2014-01-03 15:21:18, 215 K
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cicelyzh
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1. TAA是終止密碼子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表達(dá)標(biāo)簽或者其他基因。用后面基因的終止密碼子就可以了。 2. 在酶切位點(diǎn)與ATG之間加堿基一般是考慮移碼的問題。情況大概是由于在這個(gè)基因前面有其他基因或者標(biāo)簽需要融合表達(dá)。在基因的反向引物的酶切位點(diǎn)之后加堿基也是考慮移碼是問題，大概基因后面有表達(dá)標(biāo)簽或者融合蛋白。具體是什么堿基問題不是很大。主要考慮不能形成終止密碼子。我想在這里用T的原因可能是調(diào)整引物的GC含量。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
4樓2014-01-05 11:01:56
cicelyzh
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1. 主要看整體，包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 2. 設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基在PCR初期不能與模板配對，所以計(jì)算PCR的退火溫度時(shí)要去掉。過若干循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度超過原模板，引物中的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列可以與模板配對，退火溫度可以根據(jù)含有這些序列的Tm來考慮。 3. 3'端最好不要是A主要是基于即使錯(cuò)配也能延伸，如果用高保真酶的話，問題應(yīng)該不大�？紤]簡并性，是從ATG數(shù)起。酶切位點(diǎn)序列是為了方便分子操作，與你要克隆的基因無關(guān)。 |
7樓2014-01-06 11:49:42
cicelyzh
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GC含量過高有可能導(dǎo)致PCR困難，一般設(shè)計(jì)引物時(shí)考慮在50%左右，其實(shí)高于60%的引物也能P出來。尤其是做有些克隆，引物選擇的自由度不是很大。只要能P出目的條帶就可以了。 大腸桿菌的基因型可以參考： http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes 和TAKARA的免費(fèi)資料 http://pan.baidu.com/s/1nt7CWI1 |
9樓2014-01-08 01:39:00
lingbi
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2樓2014-01-04 10:02:48
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3樓2014-01-05 09:07:54
5樓2014-01-05 22:03:30
lingbi
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送紅花一朵 |
解釋非常詳細(xì)，謝謝你。我還有問題 1、是Tm值、GC含量，PPT中看是未加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基時(shí)就計(jì)算的，補(bǔ)加堿基防止移碼時(shí)補(bǔ)什么看GC含量，這是的GC含量是要計(jì)算一下含酶切位點(diǎn)什么的嗎？ 2、酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基中GC含量高，那么實(shí)驗(yàn)中退火溫度（不含酶切位點(diǎn)算的Tm）是不是5個(gè)循環(huán)后提高溫度？提高多少合適？ 3、Primer1: 5’ cgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 引物設(shè)計(jì)中說3‘端以A結(jié)尾不好，是不是直接去掉這個(gè)就行？出于簡并性考慮，引物3’端不要終止于密碼子第三位，可是從哪個(gè)地方開始數(shù)呢，這個(gè)引物擴(kuò)增出的片段插入BamHI位點(diǎn)，是從GGATTC開始數(shù)嗎？ |
6樓2014-01-06 09:58:49
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8樓2014-01-07 22:22:49
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10樓2014-01-09 15:03:32
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