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lingbi銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
引物設(shè)計實例分析 已有1人參與
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發(fā)現(xiàn)一個很好的引物設(shè)計的PPT，傳上來跟大家分析一下，同時我有幾個點沒看懂，也想請明白的朋友給指點一下。 目的： 將plasmid 2上GFP基因擴下來連到plasmid 1 上 GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 問題一： Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. 引物2 TTA為什么去掉？不需要終止密碼子嗎？ 問題二加酶切位點后： Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 添加酶切位點后為什么在primer1的酶切位點后面加個 T 呢？是為了三個一組ATG剛好一組嗎？為什么加的是T不是別的？ Primer2: 5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC為何在primer2的酶切位點后加CT？這有何講究？ 問題敘述的也許不清楚，請大俠 參看PPT給解釋一下吧。謝謝 |
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2014-01-03 15:21:18, 215 K
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cicelyzh
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GC含量過高有可能導(dǎo)致PCR困難，一般設(shè)計引物時考慮在50%左右，其實高于60%的引物也能P出來。尤其是做有些克隆，引物選擇的自由度不是很大。只要能P出目的條帶就可以了。 大腸桿菌的基因型可以參考： http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes 和TAKARA的免費資料 http://pan.baidu.com/s/1nt7CWI1 |
9樓2014-01-08 01:39:00
lingbi
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3樓2014-01-05 09:07:54
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1. TAA是終止密碼子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表達標(biāo)簽或者其他基因。用后面基因的終止密碼子就可以了。 2. 在酶切位點與ATG之間加堿基一般是考慮移碼的問題。情況大概是由于在這個基因前面有其他基因或者標(biāo)簽需要融合表達。在基因的反向引物的酶切位點之后加堿基也是考慮移碼是問題，大概基因后面有表達標(biāo)簽或者融合蛋白。具體是什么堿基問題不是很大。主要考慮不能形成終止密碼子。我想在這里用T的原因可能是調(diào)整引物的GC含量。 |
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lingbi4樓2014-01-05 11:01:56
5樓2014-01-05 22:03:30
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