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lingbi銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析 已有1人參與
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發(fā)現(xiàn)一個(gè)很好的引物設(shè)計(jì)的PPT，傳上來跟大家分析一下，同時(shí)我有幾個(gè)點(diǎn)沒看懂，也想請明白的朋友給指點(diǎn)一下。 目的： 將plasmid 2上GFP基因擴(kuò)下來連到plasmid 1 上 GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 問題一： Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. 引物2 TTA為什么去掉？不需要終止密碼子嗎？ 問題二加酶切位點(diǎn)后： Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 添加酶切位點(diǎn)后為什么在primer1的酶切位點(diǎn)后面加個(gè) T 呢？是為了三個(gè)一組ATG剛好一組嗎？為什么加的是T不是別的？ Primer2: 5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC為何在primer2的酶切位點(diǎn)后加CT？這有何講究？ 問題敘述的也許不清楚，請大俠 參看PPT給解釋一下吧。謝謝 |
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2014-01-03 15:21:18, 215 K
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cicelyzh
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1. 主要看整體，包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 2. 設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基在PCR初期不能與模板配對，所以計(jì)算PCR的退火溫度時(shí)要去掉。過若干循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度超過原模板，引物中的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列可以與模板配對，退火溫度可以根據(jù)含有這些序列的Tm來考慮。 3. 3'端最好不要是A主要是基于即使錯配也能延伸，如果用高保真酶的話，問題應(yīng)該不大�？紤]簡并性，是從ATG數(shù)起。酶切位點(diǎn)序列是為了方便分子操作，與你要克隆的基因無關(guān)。 |
7樓2014-01-06 11:49:42
lingbi
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3樓2014-01-05 09:07:54
cicelyzh
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1. TAA是終止密碼子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表達(dá)標(biāo)簽或者其他基因。用后面基因的終止密碼子就可以了。 2. 在酶切位點(diǎn)與ATG之間加堿基一般是考慮移碼的問題。情況大概是由于在這個(gè)基因前面有其他基因或者標(biāo)簽需要融合表達(dá)。在基因的反向引物的酶切位點(diǎn)之后加堿基也是考慮移碼是問題，大概基因后面有表達(dá)標(biāo)簽或者融合蛋白。具體是什么堿基問題不是很大。主要考慮不能形成終止密碼子。我想在這里用T的原因可能是調(diào)整引物的GC含量。 |
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lingbi4樓2014-01-05 11:01:56
5樓2014-01-05 22:03:30
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