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皇豬木蟲 (正式寫手)
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[求助]
基因克隆流程 已有1人參與
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春節(jié)來了，本人給大家先拜個年，祝大家馬年馬上有車，馬上有房，馬上有對象，馬上有金山。。。。。。 各位學(xué)者， 本人最近需要對100bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，按照測序公司的要求，做了基因克隆，第一次做克隆吧，測序出來的結(jié)果顯示 序列有920bp，遠(yuǎn)大于我的目的片段，而且測出的序列也不是我需要的，因年底從實(shí)驗(yàn)室回家了，這個問題還沒有進(jìn)行多深的探討，想在小木蟲 論壇上咨詢咨詢做過克隆測序的前輩，為了實(shí)現(xiàn)測序目的該怎么做基因克隆，具體流程怎樣？？？？ 再次向大家拜年，祝大家新年快樂，闔家歡樂�。�！ |
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bujunyang
木蟲 (正式寫手)
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| 建議你還是先了解一下測序原理。一個測序反應(yīng)一般可以測800到1000bp。測序的結(jié)果，前邊的幾十個堿基和最后的幾十個堿基是測不準(zhǔn)確的，所以測序公司會建議把DNA片段連接到一個載體上去，測序反應(yīng)從載體開始，這樣就可以保證你的序列不會落到最前面的幾十個堿基中。你需要做的是做連接和轉(zhuǎn)化，挑選正確的克隆送去測序，然后從返回的結(jié)果中找到你的序列。 |
3樓2014-01-30 00:16:21
Lau_Kimura
鐵蟲 (正式寫手)
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最簡單的TA克隆（Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A） Taq酶PCR，電泳檢測產(chǎn)物特異性（如有必要，切膠回收），異丙醇沉淀純化； 連接：Takara 的 pMD 18-T Vector試劑盒； 電擊轉(zhuǎn)化：取1-1.5微升重組質(zhì)粒，40微升分裝的E.coli感受態(tài)，1100V，200歐姆（1mm電擊杯）； 涂板：2倍YT培養(yǎng)基（1mL）復(fù)蘇30min后，取100微升涂布抗性篩選平板； 搖菌：挑取單菌落加入抗性LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜； PCR檢測：粗提質(zhì)粒（200微升沉淀，加50微升水重懸浮，95度7分鐘裂解，離心取2微升上清做模版）。 提質(zhì)粒，消化RNA，送測序即可。 |
2樓2014-01-29 23:32:55
4樓2014-01-31 00:59:09
5樓2014-02-02 08:21:43
6樓2014-02-02 08:24:48
10樓2014-02-05 12:38:03
皇豬
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7樓2014-02-02 13:20:09
8樓2014-02-03 07:08:41
皇豬
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9樓2014-02-04 18:13:03
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