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克隆基因選取 菜鳥��！ 已有1人參與
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求問，我要克隆出一個(gè)蛋白。那個(gè)基因一共有15個(gè)產(chǎn)物，3個(gè)有csd。我用有的csd的那個(gè)蛋白blast之后取重復(fù)的那一段aa，用軟件翻譯成DNA之后想以此為目的基因。 現(xiàn)在遇到一個(gè)問題，我是菜鳥。 1、我拿到的DNA序列時(shí)簡并序列，我要對(duì)照哪一個(gè)序列把它變成標(biāo)準(zhǔn)序列。 2、如果我查找不到啟動(dòng)子和終止子，是不是應(yīng)該在PCR的時(shí)候把這些外加酶切位點(diǎn)一起P上去。 3、我要怎么控制開放閱讀框是從哪一個(gè)開始閱讀的呢？是在目標(biāo)序列前面加3倍數(shù)的堿基，這樣就能保證如果我在克隆載體中大量克隆后，表達(dá)載體就可以按照閱讀框閱讀。還是我因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)表達(dá)載體的時(shí)候才考慮？ 還有沒有什么要注意，我之前有一個(gè)師兄設(shè)計(jì)的引物和序列，好像公司給回來的評(píng)價(jià)說產(chǎn)物太小，特異性不高，不然引物就要很長，很難成功。。他都沒有成功跟克隆載體連接。。。 謝謝！ |
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cicelyzh
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲蟲啊，鼓勵(lì)積極交流問題 2013-01-07 16:57:17
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲蟲啊，鼓勵(lì)積極交流問題 2013-01-07 16:57:17
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1. 簡并序列沒有關(guān)系的。如果你是做蛋白表達(dá)，只要氨基酸序列對(duì)就可以了。主要是看密碼子不能有表達(dá)宿主的稀有密碼，否則表達(dá)效率上不去。 2. 不知道你想在什么載體和宿主里表達(dá)。無論怎樣，一般的表達(dá)載體都有啟動(dòng)子和終止子，不需要原來基因的啟動(dòng)子和終止子，你只需要把序列從啟動(dòng)密碼子到終止密碼子這一段克隆出來就可以了。至于所加酶切位點(diǎn)，你需要根據(jù)所選的表達(dá)載體來設(shè)計(jì)。 3. 閱讀框什么的沒有關(guān)系的，翻譯的時(shí)候是尋找啟動(dòng)子下游附近的ATG開始表達(dá)的。你主要設(shè)計(jì)好你的序列，從啟動(dòng)子到你的目的基因開頭的一段最好只有一個(gè)ATG，否則可能會(huì)有多個(gè)翻譯產(chǎn)物。 最后的問題問的不是很清楚，你是讓公司給你克隆基因序列嗎？如果只是合成引物，是否好用還是自己實(shí)驗(yàn)說了算吧。只要能克隆出正確序列就可以了。 |
2樓2013-01-07 03:20:16
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謝謝啊，我最后那個(gè)問題是這樣的。 當(dāng)時(shí)我?guī)熜挚寺〉氖?05個(gè)堿基的，然后前后啥的還把酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基加上去了。公司給的回復(fù)是說如果這樣的話，105堿基很小，為了保證特異性要30個(gè)堿基以上的引物。說很難做出來什么的。那個(gè)師兄真的沒有做出來。 我現(xiàn)在是自己重新做，師兄也不在學(xué)校了。我這個(gè)實(shí)驗(yàn)是用RT-PCR一步式，從人組織細(xì)胞中克隆出一段基因，然后想做出蛋白，不過可能很難。我目前只打算做到表達(dá)載體的。我是本科生，做畢業(yè)論文的。 請(qǐng)問克隆載體和表達(dá)載體有沒有什么推薦呢？上一次用的是pGEM35（克隆質(zhì)粒）和pGC2（表達(dá)質(zhì)粒，含GST） |
3樓2013-01-07 15:23:35
cicelyzh
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| 105bp的確很小，不過也不是不行的。你確定要表達(dá)蛋白的cDNA序列只有這么小么？打算從RNA一步RT-PCR也不是不可以的。不過對(duì)于長的基因可能會(huì)有一定問題。其實(shí)你也可以不用加酶切位點(diǎn)什么的，直接克隆到T載體里，測(cè)序正確后再連到表達(dá)載體里就可以了。如果設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，也可以試著直接一步克隆到表達(dá)載體上合適的酶切位點(diǎn)，這樣可以保證表達(dá)的序列沒有多余的氨基酸�？寺『捅磉_(dá)載體很多，看你的需要。你打算在大腸桿菌里表達(dá)還是其它真核宿主？帶GST標(biāo)簽的表達(dá)載體便于純化分離。 |
4樓2013-01-08 07:58:15
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導(dǎo)師的想法是這樣的，因?yàn)槟莻�(gè)蛋白很多人都在做的是定位什么的，保守基因序列，是信號(hào)通路的重要一部分。所以他是想取多個(gè)產(chǎn)物的重復(fù)集合，類似做一類蛋白的抗體吧，上一個(gè)師兄取了4個(gè)產(chǎn)物的重復(fù)序列，就是35個(gè)aa，然后還原成的105個(gè)堿基。現(xiàn)在還在最開始，就是先把基因從人組織細(xì)胞中弄出來，大量克隆什么的。如果順利的話，就會(huì)做表達(dá)，應(yīng)該是用大腸桿菌表達(dá)的。 昨天我查了數(shù)據(jù)庫，那個(gè)基因有15個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8個(gè)編碼了蛋白。然后有3個(gè)是有CSD的。這三個(gè)蛋白的aa序列我blastp以后是有300多個(gè)連續(xù)重復(fù)的。 我現(xiàn)在搞不懂是按導(dǎo)師的想法，我是應(yīng)該用盡可能多的蛋白產(chǎn)物來blast還是取其中幾個(gè)呢？我查的大多數(shù)都是對(duì)前3個(gè)的研究。。 要是我要克隆300多個(gè)aa會(huì)很大么... 超級(jí)感謝~  |
5樓2013-01-08 10:51:23
cicelyzh
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做抗體可以不用全蛋白，只要表達(dá)蛋白的一段就可以了。而且如果是用保守區(qū)的話，可以識(shí)別多個(gè)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。我認(rèn)為你導(dǎo)師的想法是針對(duì)幾個(gè)重要的產(chǎn)物就可以了。雖然有那么多蛋白，可能有些表達(dá)量低或者功能方面沒有那么重要。此外，我覺得最好是對(duì)全蛋白整個(gè)序列分析其抗原性。最好你要表達(dá)的區(qū)段抗原性比較強(qiáng)，做出來的抗體成功率高。你要克隆300多個(gè)aa的序列還不到1kb，不算大，是非常容易克隆的。我認(rèn)為用反轉(zhuǎn)錄PCR的成功率很高的。如果可以P出來，回收PCR產(chǎn)物，克隆到載體里測(cè)序。如果序列正確就OK啦。 |
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xjtu00256樓2013-01-08 13:15:08
7樓2013-02-21 10:45:38
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8樓2013-02-22 10:47:40
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PCR產(chǎn)物包括引物序列，如果想克隆一個(gè)完整基因，5'引物一般就是從基因起始密碼子（ATG）開始大致20個(gè)核苷酸，這20個(gè)左右nt是和模板完全互補(bǔ)的。如果要加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的話就在ATG前面加，這些核苷酸是與模板不互補(bǔ)的，計(jì)算引物Tm值時(shí)要去掉，只計(jì)算互補(bǔ)堿基。3'引物是一個(gè)道理。如果你不放心可以把序列發(fā)到我郵箱里cicelyzhang@hotmail.com 如果加了酶切位點(diǎn)，可以直接克隆到表達(dá)載體里。T載體是做TA克隆用，為了方便直接把taq DNA聚合酶P出來的片段直接連到載體。如果你做了酶切位點(diǎn)的話，沒必要用T載體了。 |
10樓2013-02-23 07:36:01
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