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克隆基因選取 菜鳥(niǎo)！！ 已有1人參與
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求問(wèn)，我要克隆出一個(gè)蛋白。那個(gè)基因一共有15個(gè)產(chǎn)物，3個(gè)有csd。我用有的csd的那個(gè)蛋白blast之后取重復(fù)的那一段aa，用軟件翻譯成DNA之后想以此為目的基因。 現(xiàn)在遇到一個(gè)問(wèn)題，我是菜鳥(niǎo)。 1、我拿到的DNA序列時(shí)簡(jiǎn)并序列，我要對(duì)照哪一個(gè)序列把它變成標(biāo)準(zhǔn)序列。 2、如果我查找不到啟動(dòng)子和終止子，是不是應(yīng)該在PCR的時(shí)候把這些外加酶切位點(diǎn)一起P上去。 3、我要怎么控制開(kāi)放閱讀框是從哪一個(gè)開(kāi)始閱讀的呢？是在目標(biāo)序列前面加3倍數(shù)的堿基，這樣就能保證如果我在克隆載體中大量克隆后，表達(dá)載體就可以按照閱讀框閱讀。還是我因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)表達(dá)載體的時(shí)候才考慮？ 還有沒(méi)有什么要注意，我之前有一個(gè)師兄設(shè)計(jì)的引物和序列，好像公司給回來(lái)的評(píng)價(jià)說(shuō)產(chǎn)物太小，特異性不高，不然引物就要很長(zhǎng)，很難成功。。他都沒(méi)有成功跟克隆載體連接。。。 謝謝！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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cicelyzh
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 105bp的確很小，不過(guò)也不是不行的。你確定要表達(dá)蛋白的cDNA序列只有這么小么？打算從RNA一步RT-PCR也不是不可以的。不過(guò)對(duì)于長(zhǎng)的基因可能會(huì)有一定問(wèn)題。其實(shí)你也可以不用加酶切位點(diǎn)什么的，直接克隆到T載體里，測(cè)序正確后再連到表達(dá)載體里就可以了。如果設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，也可以試著直接一步克隆到表達(dá)載體上合適的酶切位點(diǎn)，這樣可以保證表達(dá)的序列沒(méi)有多余的氨基酸�？寺『捅磉_(dá)載體很多，看你的需要。你打算在大腸桿菌里表達(dá)還是其它真核宿主？帶GST標(biāo)簽的表達(dá)載體便于純化分離。 |
4樓2013-01-08 07:58:15
cicelyzh
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲(chóng)蟲(chóng)啊，鼓勵(lì)積極交流問(wèn)題 2013-01-07 16:57:17
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲(chóng)蟲(chóng)啊，鼓勵(lì)積極交流問(wèn)題 2013-01-07 16:57:17
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1. 簡(jiǎn)并序列沒(méi)有關(guān)系的。如果你是做蛋白表達(dá)，只要氨基酸序列對(duì)就可以了。主要是看密碼子不能有表達(dá)宿主的稀有密碼，否則表達(dá)效率上不去。 2. 不知道你想在什么載體和宿主里表達(dá)。無(wú)論怎樣，一般的表達(dá)載體都有啟動(dòng)子和終止子，不需要原來(lái)基因的啟動(dòng)子和終止子，你只需要把序列從啟動(dòng)密碼子到終止密碼子這一段克隆出來(lái)就可以了。至于所加酶切位點(diǎn)，你需要根據(jù)所選的表達(dá)載體來(lái)設(shè)計(jì)。 3. 閱讀框什么的沒(méi)有關(guān)系的，翻譯的時(shí)候是尋找啟動(dòng)子下游附近的ATG開(kāi)始表達(dá)的。你主要設(shè)計(jì)好你的序列，從啟動(dòng)子到你的目的基因開(kāi)頭的一段最好只有一個(gè)ATG，否則可能會(huì)有多個(gè)翻譯產(chǎn)物。 最后的問(wèn)題問(wèn)的不是很清楚，你是讓公司給你克隆基因序列嗎？如果只是合成引物，是否好用還是自己實(shí)驗(yàn)說(shuō)了算吧。只要能克隆出正確序列就可以了。 |
2樓2013-01-07 03:20:16
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謝謝啊，我最后那個(gè)問(wèn)題是這樣的。 當(dāng)時(shí)我?guī)熜挚寺〉氖?05個(gè)堿基的，然后前后啥的還把酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基加上去了。公司給的回復(fù)是說(shuō)如果這樣的話，105堿基很小，為了保證特異性要30個(gè)堿基以上的引物。說(shuō)很難做出來(lái)什么的。那個(gè)師兄真的沒(méi)有做出來(lái)。 我現(xiàn)在是自己重新做，師兄也不在學(xué)校了。我這個(gè)實(shí)驗(yàn)是用RT-PCR一步式，從人組織細(xì)胞中克隆出一段基因，然后想做出蛋白，不過(guò)可能很難。我目前只打算做到表達(dá)載體的。我是本科生，做畢業(yè)論文的。 請(qǐng)問(wèn)克隆載體和表達(dá)載體有沒(méi)有什么推薦呢？上一次用的是pGEM35（克隆質(zhì)粒）和pGC2（表達(dá)質(zhì)粒，含GST） |
3樓2013-01-07 15:23:35
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導(dǎo)師的想法是這樣的，因?yàn)槟莻�(gè)蛋白很多人都在做的是定位什么的，保守基因序列，是信號(hào)通路的重要一部分。所以他是想取多個(gè)產(chǎn)物的重復(fù)集合，類(lèi)似做一類(lèi)蛋白的抗體吧，上一個(gè)師兄取了4個(gè)產(chǎn)物的重復(fù)序列，就是35個(gè)aa，然后還原成的105個(gè)堿基。現(xiàn)在還在最開(kāi)始，就是先把基因從人組織細(xì)胞中弄出來(lái)，大量克隆什么的。如果順利的話，就會(huì)做表達(dá)，應(yīng)該是用大腸桿菌表達(dá)的。 昨天我查了數(shù)據(jù)庫(kù)，那個(gè)基因有15個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8個(gè)編碼了蛋白。然后有3個(gè)是有CSD的。這三個(gè)蛋白的aa序列我blastp以后是有300多個(gè)連續(xù)重復(fù)的。 我現(xiàn)在搞不懂是按導(dǎo)師的想法，我是應(yīng)該用盡可能多的蛋白產(chǎn)物來(lái)blast還是取其中幾個(gè)呢？我查的大多數(shù)都是對(duì)前3個(gè)的研究。。 要是我要克隆300多個(gè)aa會(huì)很大么... 超級(jí)感謝~  |
5樓2013-01-08 10:51:23
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