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[交流]
克隆基因選取 菜鳥�。� 已有1人參與
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求問，我要克隆出一個蛋白。那個基因一共有15個產(chǎn)物，3個有csd。我用有的csd的那個蛋白blast之后取重復的那一段aa，用軟件翻譯成DNA之后想以此為目的基因。 現(xiàn)在遇到一個問題，我是菜鳥。 1、我拿到的DNA序列時簡并序列，我要對照哪一個序列把它變成標準序列。 2、如果我查找不到啟動子和終止子，是不是應該在PCR的時候把這些外加酶切位點一起P上去。 3、我要怎么控制開放閱讀框是從哪一個開始閱讀的呢？是在目標序列前面加3倍數(shù)的堿基，這樣就能保證如果我在克隆載體中大量克隆后，表達載體就可以按照閱讀框閱讀。還是我因為在設計表達載體的時候才考慮？ 還有沒有什么要注意，我之前有一個師兄設計的引物和序列，好像公司給回來的評價說產(chǎn)物太小，特異性不高，不然引物就要很長，很難成功。。他都沒有成功跟克隆載體連接。。。 謝謝！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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cicelyzh
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1. 簡并序列沒有關系的。如果你是做蛋白表達，只要氨基酸序列對就可以了。主要是看密碼子不能有表達宿主的稀有密碼，否則表達效率上不去。 2. 不知道你想在什么載體和宿主里表達。無論怎樣，一般的表達載體都有啟動子和終止子，不需要原來基因的啟動子和終止子，你只需要把序列從啟動密碼子到終止密碼子這一段克隆出來就可以了。至于所加酶切位點，你需要根據(jù)所選的表達載體來設計。 3. 閱讀框什么的沒有關系的，翻譯的時候是尋找啟動子下游附近的ATG開始表達的。你主要設計好你的序列，從啟動子到你的目的基因開頭的一段最好只有一個ATG，否則可能會有多個翻譯產(chǎn)物。 最后的問題問的不是很清楚，你是讓公司給你克隆基因序列嗎？如果只是合成引物，是否好用還是自己實驗說了算吧。只要能克隆出正確序列就可以了。 |
2樓2013-01-07 03:20:16
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謝謝啊，我最后那個問題是這樣的。 當時我?guī)熜挚寺〉氖?05個堿基的，然后前后啥的還把酶切位點，保護堿基加上去了。公司給的回復是說如果這樣的話，105堿基很小，為了保證特異性要30個堿基以上的引物。說很難做出來什么的。那個師兄真的沒有做出來。 我現(xiàn)在是自己重新做，師兄也不在學校了。我這個實驗是用RT-PCR一步式，從人組織細胞中克隆出一段基因，然后想做出蛋白，不過可能很難。我目前只打算做到表達載體的。我是本科生，做畢業(yè)論文的。 請問克隆載體和表達載體有沒有什么推薦呢？上一次用的是pGEM35（克隆質(zhì)粒）和pGC2（表達質(zhì)粒，含GST） |
3樓2013-01-07 15:23:35
cicelyzh
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4樓2013-01-08 07:58:15
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導師的想法是這樣的，因為那個蛋白很多人都在做的是定位什么的，保守基因序列，是信號通路的重要一部分。所以他是想取多個產(chǎn)物的重復集合，類似做一類蛋白的抗體吧，上一個師兄取了4個產(chǎn)物的重復序列，就是35個aa，然后還原成的105個堿基�，F(xiàn)在還在最開始，就是先把基因從人組織細胞中弄出來，大量克隆什么的。如果順利的話，就會做表達，應該是用大腸桿菌表達的。 昨天我查了數(shù)據(jù)庫，那個基因有15個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8個編碼了蛋白。然后有3個是有CSD的。這三個蛋白的aa序列我blastp以后是有300多個連續(xù)重復的。 我現(xiàn)在搞不懂是按導師的想法，我是應該用盡可能多的蛋白產(chǎn)物來blast還是取其中幾個呢？我查的大多數(shù)都是對前3個的研究。。 要是我要克隆300多個aa會很大么... 超級感謝~  |
5樓2013-01-08 10:51:23
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做抗體可以不用全蛋白，只要表達蛋白的一段就可以了。而且如果是用保守區(qū)的話，可以識別多個的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。我認為你導師的想法是針對幾個重要的產(chǎn)物就可以了。雖然有那么多蛋白，可能有些表達量低或者功能方面沒有那么重要。此外，我覺得最好是對全蛋白整個序列分析其抗原性。最好你要表達的區(qū)段抗原性比較強，做出來的抗體成功率高。你要克隆300多個aa的序列還不到1kb，不算大，是非常容易克隆的。我認為用反轉(zhuǎn)錄PCR的成功率很高的。如果可以P出來，回收PCR產(chǎn)物，克隆到載體里測序。如果序列正確就OK啦。 |
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xjtu00256樓2013-01-08 13:15:08
7樓2013-02-21 10:45:38
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8樓2013-02-22 10:47:40
9樓2013-02-22 15:09:47
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PCR產(chǎn)物包括引物序列，如果想克隆一個完整基因，5'引物一般就是從基因起始密碼子（ATG）開始大致20個核苷酸，這20個左右nt是和模板完全互補的。如果要加酶切位點和保護堿基的話就在ATG前面加，這些核苷酸是與模板不互補的，計算引物Tm值時要去掉，只計算互補堿基。3'引物是一個道理。如果你不放心可以把序列發(fā)到我郵箱里cicelyzhang@hotmail.com 如果加了酶切位點，可以直接克隆到表達載體里。T載體是做TA克隆用，為了方便直接把taq DNA聚合酶P出來的片段直接連到載體。如果你做了酶切位點的話，沒必要用T載體了。 |
10樓2013-02-23 07:36:01
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