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克隆基因選取 菜鳥��！ 已有1人參與
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求問，我要克隆出一個蛋白。那個基因一共有15個產(chǎn)物，3個有csd。我用有的csd的那個蛋白blast之后取重復(fù)的那一段aa，用軟件翻譯成DNA之后想以此為目的基因。 現(xiàn)在遇到一個問題，我是菜鳥。 1、我拿到的DNA序列時(shí)簡并序列，我要對照哪一個序列把它變成標(biāo)準(zhǔn)序列。 2、如果我查找不到啟動子和終止子，是不是應(yīng)該在PCR的時(shí)候把這些外加酶切位點(diǎn)一起P上去。 3、我要怎么控制開放閱讀框是從哪一個開始閱讀的呢？是在目標(biāo)序列前面加3倍數(shù)的堿基，這樣就能保證如果我在克隆載體中大量克隆后，表達(dá)載體就可以按照閱讀框閱讀。還是我因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)表達(dá)載體的時(shí)候才考慮？ 還有沒有什么要注意，我之前有一個師兄設(shè)計(jì)的引物和序列，好像公司給回來的評價(jià)說產(chǎn)物太小，特異性不高，不然引物就要很長，很難成功。。他都沒有成功跟克隆載體連接。。。 謝謝！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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送鮮花一朵 
7樓2013-02-21 10:45:38
cicelyzh
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲蟲啊，鼓勵積極交流問題 2013-01-07 16:57:17
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 真是熱心的蟲蟲啊，鼓勵積極交流問題 2013-01-07 16:57:17
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1. 簡并序列沒有關(guān)系的。如果你是做蛋白表達(dá)，只要氨基酸序列對就可以了。主要是看密碼子不能有表達(dá)宿主的稀有密碼，否則表達(dá)效率上不去。 2. 不知道你想在什么載體和宿主里表達(dá)。無論怎樣，一般的表達(dá)載體都有啟動子和終止子，不需要原來基因的啟動子和終止子，你只需要把序列從啟動密碼子到終止密碼子這一段克隆出來就可以了。至于所加酶切位點(diǎn)，你需要根據(jù)所選的表達(dá)載體來設(shè)計(jì)。 3. 閱讀框什么的沒有關(guān)系的，翻譯的時(shí)候是尋找啟動子下游附近的ATG開始表達(dá)的。你主要設(shè)計(jì)好你的序列，從啟動子到你的目的基因開頭的一段最好只有一個ATG，否則可能會有多個翻譯產(chǎn)物。 最后的問題問的不是很清楚，你是讓公司給你克隆基因序列嗎？如果只是合成引物，是否好用還是自己實(shí)驗(yàn)說了算吧。只要能克隆出正確序列就可以了。 |
2樓2013-01-07 03:20:16
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謝謝啊，我最后那個問題是這樣的。 當(dāng)時(shí)我?guī)熜挚寺〉氖?05個堿基的，然后前后啥的還把酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基加上去了。公司給的回復(fù)是說如果這樣的話，105堿基很小，為了保證特異性要30個堿基以上的引物。說很難做出來什么的。那個師兄真的沒有做出來。 我現(xiàn)在是自己重新做，師兄也不在學(xué)校了。我這個實(shí)驗(yàn)是用RT-PCR一步式，從人組織細(xì)胞中克隆出一段基因，然后想做出蛋白，不過可能很難。我目前只打算做到表達(dá)載體的。我是本科生，做畢業(yè)論文的。 請問克隆載體和表達(dá)載體有沒有什么推薦呢？上一次用的是pGEM35（克隆質(zhì)粒）和pGC2（表達(dá)質(zhì)粒，含GST） |
3樓2013-01-07 15:23:35
cicelyzh
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| 105bp的確很小，不過也不是不行的。你確定要表達(dá)蛋白的cDNA序列只有這么小么？打算從RNA一步RT-PCR也不是不可以的。不過對于長的基因可能會有一定問題。其實(shí)你也可以不用加酶切位點(diǎn)什么的，直接克隆到T載體里，測序正確后再連到表達(dá)載體里就可以了。如果設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，也可以試著直接一步克隆到表達(dá)載體上合適的酶切位點(diǎn)，這樣可以保證表達(dá)的序列沒有多余的氨基酸。克隆和表達(dá)載體很多，看你的需要。你打算在大腸桿菌里表達(dá)還是其它真核宿主？帶GST標(biāo)簽的表達(dá)載體便于純化分離。 |
4樓2013-01-08 07:58:15
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