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wangdunzju新蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白SDSPAGE電泳遇到分子量漂移，變大30多kDa! 已有1人參與
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最近在做蛋白的SDS-PAGE電泳，遇到目的蛋白分子量漂移的現(xiàn)象，請(qǐng)各位大俠給鑒定一下原因： 我的目的蛋白等電點(diǎn)為7.2，基因序列已知，可以預(yù)測(cè)其分子量為42kDa左右。用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白做WB檢驗(yàn)后，證明蛋白分子量與預(yù)測(cè)的一致。 因?yàn)楹竺嬉鲆恍┡c功能相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，想用可溶的體系提取蛋白。 我于是用不同pH值的提取液（Tris體系），分為5,7,9三個(gè)PH梯度分別提取煙草葉片蛋白，四度離心15分鐘（13000rpm），然后將每個(gè)樣品的上清（可溶性組分）與沉淀組分（不溶性組分）分別制樣，用于WB檢測(cè)，結(jié)果如下： 如圖，TCA法雜出42kDa的目的條帶，與預(yù)測(cè)分子量一致；而上清組分中沒有雜出目的條帶；沉淀組分中在高pH提取液樣品中雜出一個(gè)約70kDa的目的帶！這讓我很糾結(jié)，怎么分子量會(huì)變大呢？蛋白二聚體應(yīng)該不可能，因?yàn)槭荢DS-page電泳，SDS會(huì)打斷亞基之間的結(jié)構(gòu)，況且制樣時(shí)用上樣緩沖液煮過10分鐘。那么是什么原因使蛋白的表觀分子量變大了呢？我懷疑是是不是蛋白與核酸結(jié)合導(dǎo)致蛋白跑慢了，但不知道SDS-page電泳會(huì)不會(huì)導(dǎo)致核酸與蛋白的結(jié)合被破壞，所以不敢下這個(gè)結(jié)論。或者還有什么別的什么因素導(dǎo)致這樣的結(jié)果？有這方面經(jīng)驗(yàn)的蟲友幫忙診斷一下啊！多謝了！ 祝蟲友馬年有一切！ [ Last edited by wangdunzju on 2014-2-9 at 15:21 ] |
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wangdunzju
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SDS上樣緩沖液是否加了巰基乙醇或者DTT？核酸蛋白復(fù)合物在SDS作用下一般會(huì)被打斷。如果你不能確定，可以用核酸酶消化樣品后與未做消化的比較。 |
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wangdunzju3樓2014-02-10 13:56:40
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