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5‘Race驗證miRNA靶點的原理 已有2人參與
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大家好，近期內(nèi)急需做驗證miRNA靶點的實驗，考慮要用RACE，但是首次接觸，感覺很多問題想不明白， 頭都要漲破了，于是在自己繼續(xù)摸索的同時，想請有這方面經(jīng)驗的蟲友賜教，先表示感謝  1.我研究的物種是一個基因組沒測過序的，但有其對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組，這樣可否進行實驗驗證？ 2.如果可以，那么動物miRNA怎么在對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本里找尋相對應(yīng)的靶標(biāo)序列（種子序列完全互補？其余序列 允許幾個錯配？大概需要上下幾kb?）？ 3.miRNA應(yīng)該跟mRNA 3‘UTR結(jié)合，那為什么要用5’RACE (主要是擴5‘UTR)，而不是用3’URT？是因為反轉(zhuǎn)錄 出來的cDNA跟實際的mRNA是互補的嗎？如果是這樣，那么特異性引物設(shè)計的時候應(yīng)該是跟mRNA序列一致 的而非反向互補吧。 4.具體試劑盒考慮買Takara的，不知道其效果怎樣？大概多久能出結(jié)果？ 5.有沒有動物中做5‘RACE驗證miRNA靶標(biāo)相關(guān)的文獻可以推薦？ 這些問題時本人懷著極其虔誠而又焦慮的心情寫下的，怕寫少了，見這不明所以；寫的多了，又覺啰嗦，請親們不吝賜教吧！ 搬個小板凳在線等~~~  : |
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 出國！！ | miRNA測序數(shù)據(jù)分析 | 蟲友問答-分子生物 |
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9樓2014-02-19 16:28:07
kaixinla168
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傲雪清霜2樓2014-02-17 08:25:56
，謝謝看帖，送個小紅花 3樓2014-02-17 17:47:16
yipan 
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵交流 2014-02-18 11:47:22
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵交流 2014-02-18 11:47:22
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轉(zhuǎn)錄組是指某個物種或特定細胞在某一生理功能狀態(tài)下，細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄的mRNA產(chǎn)物的集合，包含了時間和空間的限定，是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。 應(yīng)用高通量技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序是一種快捷可靠的獲取轉(zhuǎn)錄組信息的方法。派森諾生物提供mRNA的轉(zhuǎn)錄本表達分析，通過獲得研究對象基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的信息，鑒定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點，可變剪切等，其精確的計數(shù)方法更可對基因進行精確的定量分析。 一、技術(shù)路線 轉(zhuǎn)錄組的高通量測序包含兩部分內(nèi)容：①有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(Transcriptome analysis with reference genome)；②無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(De novotranscriptome analysis)。 1、有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)路線 優(yōu)選平臺：Illumina HiSeq測序平臺采用雙端測序方法，單次測序獲得的數(shù)據(jù)量大，能夠得到更高的覆蓋深度，檢測更多低豐度的轉(zhuǎn)錄本。Illumina MiSeq測序平臺操作靈活，不需要跟別的樣本湊足一個Run，只要您的樣品準(zhǔn)備好了，平臺馬上能為您運行。 派森諾生物Illumina 測序平臺結(jié)合成熟的生物信息學(xué)分析系統(tǒng)，是基因組序列已知物種的轉(zhuǎn)錄組分析的最佳選擇。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機引物cDNA合成 上機測序 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學(xué)分析 高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) 2、無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析 優(yōu)選平臺：在Roche 454 FLX基礎(chǔ)上發(fā)展起來的Roche 454 FLX+，有著成熟的分析軟件和分析流程，具有長度長的優(yōu)勢，易于后續(xù)拼接和生物信息分析，提供最接近轉(zhuǎn)錄本長度的高通量測序數(shù)據(jù)。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機引物cDNA合成 454 FLX+上機測序 De novo組裝 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學(xué)分析 高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) 二、生物信息學(xué)分析 1）有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理 b)map到基因組 c)基因組注釋整理及表達量分析 d)表達差異分析 e)表達差異GO聚類分析 f)基因覆蓋分析 g)SNP分析 h)KEGG pathway分析 i)可變剪切分析 j)基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及新基因發(fā)現(xiàn) 2）無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理 b)Contig和Unigene統(tǒng)計分析 c)Unigene功能注釋 d)表達差異分析 e)表達差異GO聚類分析 f)KEGG pathway分析 g)SNP分析 h)SSR分析 三、 常見問題解答 1、Q: 轉(zhuǎn)錄組測序與其他方法相比有哪些優(yōu)勢？ A: 相對于傳統(tǒng)芯片而言，轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用范圍廣，無需預(yù)先設(shè)計探針或了解物種的基因信息，即可對任意物種進行轉(zhuǎn)錄組測序，能夠提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，同時能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，預(yù)測新的基因，檢測可變剪切，SNPs，融合基因等，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具。 技術(shù) 芯片技術(shù) cDNA/EST測序 轉(zhuǎn)錄組測序 手段 雜交 一代測序 二代測序 分辨率 ＜100bp 單個堿基 單個堿基 通量 較高 低 高 是否依賴參考序列 是 否 否 背景噪音 強 弱 弱 檢測靈敏度 低 高 高 需提供的RNA總量 高 高 低 2、Q: 進行轉(zhuǎn)錄組測序有哪些注意事項？ A: 1)RNA的質(zhì)量好壞會嚴(yán)重影響測序的質(zhì)量： ①RNA的3’端發(fā)生降解，則無法通過3’端的poly A尾捕獲mRNA，反轉(zhuǎn)錄后進行測序也無法得到全部的cDNA； ②若RNA的5’端發(fā)生降解，即使通過3’端的poly A捕獲得到mRNA，測序結(jié)果也將出現(xiàn)明顯的3’和5’偏向性。 2)若RNA濃度較低時，也會影響測序的質(zhì)量�？赏ㄟ^增加PCR擴增循環(huán)數(shù)的方法獲得足夠的量用于后續(xù)測序。 3)測序信號和準(zhǔn)確性會因文庫中poly A多聚物的存在發(fā)生一定的偏差。 3、Q: 如何進行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析？ A: 針對原核生物的mRNA沒有poly A尾巴的情況，需要提供純化后的原核生物mRNA或cDNA樣品。 4、Q: 對于有參考基因組序列和沒有參考基因組序列的情況，派森諾生物曾做過哪些物種的轉(zhuǎn)錄組測序分析？ A: 派森諾生物已與國內(nèi)外多個知名的高校與研究所開展了多種模式生物及主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)錄組分析，例如玉米、雞和人等十幾個物種，從這些轉(zhuǎn)錄組的分析研究中發(fā)現(xiàn)了很多新結(jié)構(gòu)、新基因，派森諾生物也做過多種無參考基因組物種的轉(zhuǎn)錄組測序和分析，包括鵝，綠藻等，為這些物種的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 5、Q: 轉(zhuǎn)錄組測序需要多少測序量？ A: 轉(zhuǎn)錄組測序所需的測序量隨物種轉(zhuǎn)錄組大小的不同而有所差異。而轉(zhuǎn)錄組的大小受基因數(shù)目和豐度雙重影響，不同物種間變化很大。因此在測序之前，需要對轉(zhuǎn)錄組的大小進行評估。①針對有參考基因組的物種，可通過分析基因組信息，統(tǒng)計編碼基因個數(shù)及其堿基數(shù)來評估轉(zhuǎn)錄組的大小，同時也可參考相近或相關(guān)物種轉(zhuǎn)錄組研究的文章；②針對無參考基因組的物種，只能參考相近物種的轉(zhuǎn)錄組大小。 |
4樓2014-02-18 10:40:11
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