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5‘Race驗證miRNA靶點的原理 已有2人參與
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大家好，近期內(nèi)急需做驗證miRNA靶點的實驗，考慮要用RACE，但是首次接觸，感覺很多問題想不明白， 頭都要漲破了，于是在自己繼續(xù)摸索的同時，想請有這方面經(jīng)驗的蟲友賜教，先表示感謝  1.我研究的物種是一個基因組沒測過序的，但有其對應的轉(zhuǎn)錄組，這樣可否進行實驗驗證？ 2.如果可以，那么動物miRNA怎么在對應的轉(zhuǎn)錄本里找尋相對應的靶標序列（種子序列完全互補？其余序列 允許幾個錯配？大概需要上下幾kb?）？ 3.miRNA應該跟mRNA 3‘UTR結(jié)合，那為什么要用5’RACE (主要是擴5‘UTR)，而不是用3’URT？是因為反轉(zhuǎn)錄 出來的cDNA跟實際的mRNA是互補的嗎？如果是這樣，那么特異性引物設計的時候應該是跟mRNA序列一致 的而非反向互補吧。 4.具體試劑盒考慮買Takara的，不知道其效果怎樣？大概多久能出結(jié)果？ 5.有沒有動物中做5‘RACE驗證miRNA靶標相關的文獻可以推薦？ 這些問題時本人懷著極其虔誠而又焦慮的心情寫下的，怕寫少了，見這不明所以；寫的多了，又覺啰嗦，請親們不吝賜教吧！ 搬個小板凳在線等~~~  : |
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 出國��！ | miRNA測序數(shù)據(jù)分析 | 蟲友問答-分子生物 |
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【答案】應助回帖
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傲雪清霜: 金幣+28, ★★★很有幫助, 很有用的答復，謝謝你的熱心回答^_^～ 2014-02-19 14:55:59
gyesang: 金幣+5, 鼓勵回帖交流！ 2014-02-19 17:19:18
gyesang: 回帖置頂 2014-02-23 23:49:08
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gyesang: 回帖置頂 2014-02-23 23:49:08
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1、基因組數(shù)據(jù)無所謂。但要有RNA數(shù)據(jù)，就是說，要知道m(xù)iRNA和（預測的）靶基因在你要研究的物種里的數(shù)據(jù)（這是顯而易見的，否則根本沒法設計引物）。 2、用預測軟件。植物的我用這個http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3，操作很簡單。動物的你自己找找吧，照理說動物的資源比植物的多得多。 3、引物斷裂物的5'末端比較穩(wěn)定。5'RACE只是指擴展5'端，不特指擴5'UTR。特異引物設計應與mRNA序列反向互補。這與cDNA和mRNA是否互補沒有關系，這個必須搞明白，請仔細回顧一下PCR的過程。 4、試劑盒沒用過，應該都無問題。運氣好，第一天提RNA，連RNA接頭；第二天逆轉(zhuǎn)錄，做巢式PCR，跑膠回收目的條帶；第三天測序；第四天分析結(jié)果......運氣好的話。 5、我做植物的，不知道。印象中5'RACE實驗在動物中不是主流。 問題寫多了好，啰嗦總比使人莫名其妙強。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
傲雪清霜6樓2014-02-19 09:08:42
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silicare: 回帖置頂 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代發(fā)): 金幣+50, 樓主獎勵 2014-02-25 17:35:55
silicare: 回帖置頂 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代發(fā)): 金幣+50, 樓主獎勵 2014-02-25 17:35:55
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如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話，我一般先切膠回收，用回收物重做一次PCR然后送去測序�？纯茨膫�條帶測序結(jié)果與實驗預期相符再做轉(zhuǎn)化，然后挑10個克隆再測序。 我翻翻以前的文字....貼下面吧： 這里不建議進行藍白斑篩選。因為5'RACE片段一般較短且在編碼區(qū)，該片段插入T載體后很可能（17 % ～ 100 %的概率）并不打斷LacZ基因的ORF，因而藍白斑篩選并無太大意義，反而可能使人選擇性地避開藍斑而漏檢部分有效的片段。 然后是5'RACE的一些原理，水平有限，僅作參考： 生物體內(nèi)RNA由于受RISC切割等原因，會斷裂成截斷的片段。若想對切割的位點進行檢測，需要檢測出“3'端斷裂產(chǎn)物”的5'末端堿基序列，即可推測出切割位點，而這可以通過進行RLM-5'RACE實驗實現(xiàn)。理論上對“5'端斷裂產(chǎn)物”進行3'RACE能實現(xiàn)同樣的目的，但因為RNA一般從3'端開始降解，故對更穩(wěn)定的5'端進行RACE實驗更為合適。 檢測斷裂位點的RLM-5'RACE實驗步驟比檢測全長的5'RACE簡單，簡述如下：提取RNA，給RNA連上人工接頭，按常規(guī)流程進行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)接頭序列及目標RNA的已知序列合成引物對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR，PCR產(chǎn)物送測序，分析測序結(jié)果。 其中有以下細節(jié)需要了解： 接頭是否能順利連接？如何防止接頭的自連？RNA被RISC切割后，斷裂形成的5'端帶有Pi-基團，因此可以在RNA Ligase的作用下與人工合成的RNA接頭（單鏈RNA短片段）連接。人工合成的RNA接頭由于兩端都是OH-基團，不會發(fā)生自連，也不會與RNA的3'端連接。而且由于添加的RNA接頭是過量的，因此RNA斷裂片段間的連接可以忽略。綜上，可以保證連接產(chǎn)物絕大部分為“RNA接頭--斷裂的RNA片段”。 RNA接頭如何設計？接頭的設計并未找到什么指導原則，有興趣可以再翻翻文獻。但已知有以下幾點：商業(yè)化試劑盒里的接頭很少會形成發(fā)夾環(huán)或者二聚體結(jié)構(gòu)，為保險起見自行設計時也應避免形成二級結(jié)構(gòu)。接頭3'端應以AAA結(jié)尾，因為據(jù)文獻報道3'端為A能提高連接效率，連續(xù)三個A能保證即使接頭由于降解或合成缺陷而缺失一兩個堿基，末尾仍然是A。RNA接頭可以盡量長，以便在其上設計引物，但一般公司似乎只能合成45 nt，這也可以滿足實驗要求。 SMART-5'RACE并不適用于本實驗，因為該技術對斷裂的RNA片段不敏感，具體原因可以參看SMART RACE的說明書。至于其它RACE技術是否適用，需具體情況具體分析。 為什么5'RACE能說明miRNA對靶標RNA的切割？ 體內(nèi)RNA由于各種原因，常會在不同位點斷成長短不同的片段。假如一個RNA沒受到什么位點特異的機制對其降解，那么我們?nèi)绻麑ζ溥M行5'RACE，可以很合理地推測會檢測到很多不同大小的片段，而且這些片段的亮度應該都差不多。 但假如我們做完5'RACE以后發(fā)現(xiàn)，某個長度的片段（對應RNA某個位點的斷開事件）特別亮，那么我們就可以很合理地推測這個RNA似乎是受到某種位點特異的降解機制調(diào)控的。 假如幸運地發(fā)現(xiàn)，那個特別容易斷開的位點正好被預測是能與miRNA結(jié)合的，那么我們就可以很有把握地推測這個位點的斷開事件其實都是這個miRNA的功勞。 呃.....不過有意找茬的時候也可以說這只是巧合： 假如一條RNA 2000 nt； 假如在那上面預測到一個miRNA的結(jié)合位點； 假如由于隨機和巧合的原因，任意一條RNA上總有那么1~2個位點相對而言特別容易斷開； 那么這個特別容易斷開的位點正好位于預測的miRNA結(jié)合位點中間2個堿基上時的概率是1/（2000/2/2）=0.2% 這個概率不算大，但也并非完全沒有可能。 |
20樓2014-02-25 16:34:08
7樓2014-02-19 15:13:15
10樓2014-02-19 17:03:42
kaixinla168
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傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵交流 2014-02-18 11:47:22
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵交流 2014-02-18 11:47:22
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轉(zhuǎn)錄組是指某個物種或特定細胞在某一生理功能狀態(tài)下，細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄的mRNA產(chǎn)物的集合，包含了時間和空間的限定，是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。 應用高通量技術進行轉(zhuǎn)錄組測序是一種快捷可靠的獲取轉(zhuǎn)錄組信息的方法。派森諾生物提供mRNA的轉(zhuǎn)錄本表達分析，通過獲得研究對象基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的信息，鑒定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點，可變剪切等，其精確的計數(shù)方法更可對基因進行精確的定量分析。 一、技術路線 轉(zhuǎn)錄組的高通量測序包含兩部分內(nèi)容：①有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(Transcriptome analysis with reference genome)；②無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(De novotranscriptome analysis)。 1、有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析技術路線 優(yōu)選平臺：Illumina HiSeq測序平臺采用雙端測序方法，單次測序獲得的數(shù)據(jù)量大，能夠得到更高的覆蓋深度，檢測更多低豐度的轉(zhuǎn)錄本。Illumina MiSeq測序平臺操作靈活，不需要跟別的樣本湊足一個Run，只要您的樣品準備好了，平臺馬上能為您運行。 派森諾生物Illumina 測序平臺結(jié)合成熟的生物信息學分析系統(tǒng)，是基因組序列已知物種的轉(zhuǎn)錄組分析的最佳選擇。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機引物cDNA合成 上機測序 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學分析 高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) 2、無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析 優(yōu)選平臺：在Roche 454 FLX基礎上發(fā)展起來的Roche 454 FLX+，有著成熟的分析軟件和分析流程，具有長度長的優(yōu)勢，易于后續(xù)拼接和生物信息分析，提供最接近轉(zhuǎn)錄本長度的高通量測序數(shù)據(jù)。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機引物cDNA合成 454 FLX+上機測序 De novo組裝 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學分析 高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) 二、生物信息學分析 1）有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理 b)map到基因組 c)基因組注釋整理及表達量分析 d)表達差異分析 e)表達差異GO聚類分析 f)基因覆蓋分析 g)SNP分析 h)KEGG pathway分析 i)可變剪切分析 j)基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及新基因發(fā)現(xiàn) 2）無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理 b)Contig和Unigene統(tǒng)計分析 c)Unigene功能注釋 d)表達差異分析 e)表達差異GO聚類分析 f)KEGG pathway分析 g)SNP分析 h)SSR分析 三、 常見問題解答 1、Q: 轉(zhuǎn)錄組測序與其他方法相比有哪些優(yōu)勢？ A: 相對于傳統(tǒng)芯片而言，轉(zhuǎn)錄組測序應用范圍廣，無需預先設計探針或了解物種的基因信息，即可對任意物種進行轉(zhuǎn)錄組測序，能夠提供更精確的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，同時能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，預測新的基因，檢測可變剪切，SNPs，融合基因等，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復雜性的強大工具。 技術 芯片技術 cDNA/EST測序 轉(zhuǎn)錄組測序 手段 雜交 一代測序 二代測序 分辨率 ＜100bp 單個堿基 單個堿基 通量 較高 低 高 是否依賴參考序列 是 否 否 背景噪音 強 弱 弱 檢測靈敏度 低 高 高 需提供的RNA總量 高 高 低 2、Q: 進行轉(zhuǎn)錄組測序有哪些注意事項？ A: 1)RNA的質(zhì)量好壞會嚴重影響測序的質(zhì)量： ①RNA的3’端發(fā)生降解，則無法通過3’端的poly A尾捕獲mRNA，反轉(zhuǎn)錄后進行測序也無法得到全部的cDNA； ②若RNA的5’端發(fā)生降解，即使通過3’端的poly A捕獲得到mRNA，測序結(jié)果也將出現(xiàn)明顯的3’和5’偏向性。 2)若RNA濃度較低時，也會影響測序的質(zhì)量�？赏ㄟ^增加PCR擴增循環(huán)數(shù)的方法獲得足夠的量用于后續(xù)測序。 3)測序信號和準確性會因文庫中poly A多聚物的存在發(fā)生一定的偏差。 3、Q: 如何進行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析？ A: 針對原核生物的mRNA沒有poly A尾巴的情況，需要提供純化后的原核生物mRNA或cDNA樣品。 4、Q: 對于有參考基因組序列和沒有參考基因組序列的情況，派森諾生物曾做過哪些物種的轉(zhuǎn)錄組測序分析？ A: 派森諾生物已與國內(nèi)外多個知名的高校與研究所開展了多種模式生物及主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)錄組分析，例如玉米、雞和人等十幾個物種，從這些轉(zhuǎn)錄組的分析研究中發(fā)現(xiàn)了很多新結(jié)構(gòu)、新基因，派森諾生物也做過多種無參考基因組物種的轉(zhuǎn)錄組測序和分析，包括鵝，綠藻等，為這些物種的深入研究奠定了良好的基礎。 5、Q: 轉(zhuǎn)錄組測序需要多少測序量？ A: 轉(zhuǎn)錄組測序所需的測序量隨物種轉(zhuǎn)錄組大小的不同而有所差異。而轉(zhuǎn)錄組的大小受基因數(shù)目和豐度雙重影響，不同物種間變化很大。因此在測序之前，需要對轉(zhuǎn)錄組的大小進行評估。①針對有參考基因組的物種，可通過分析基因組信息，統(tǒng)計編碼基因個數(shù)及其堿基數(shù)來評估轉(zhuǎn)錄組的大小，同時也可參考相近或相關物種轉(zhuǎn)錄組研究的文章；②針對無參考基因組的物種，只能參考相近物種的轉(zhuǎn)錄組大小。 |
4樓2014-02-18 10:40:11
kaixinla168
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5樓2014-02-19 02:28:36
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動物做RACE的少，是因為據(jù)說大部分情況下，動物microRNA對RNA進行翻譯抑制，并不切斷RNA，也就不能做RACE了。 1、我自己會選250～1000。為的是跑膠和PCR都比較方便。檢驗一般不做吧，設計引物的時候注意和上游引物匹配就ok了。 2、無論跑出幾條帶都正常....如果你的實驗假設正確的話，那至少應該看到有預測長度的產(chǎn)物，把這條產(chǎn)物切下來分別測序就可以。為保險起見可以把目標產(chǎn)物附近的條帶也切下來測序。 要驗證動物靶RNA的話還是多準備后路吧，譬如說把預測的靶點連到熒光蛋白，看熒光蛋白的表達會不會被miRNA抑制什么的。 |
8樓2014-02-19 16:12:24
9樓2014-02-19 16:28:07
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