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傲雪清霜

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10樓: Originally posted by Carnity at 2014-02-19 17:03:42
最近也在關注microRNA的做法，還沒著手做，先收個貼，灌個水，以后整明白了別忘了教教我哈

共同學習~

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有時候我可以理解這個世界，有時候又什么都不懂~

11樓2014-02-21 12:40:25

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8樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 16:12:24
動物做RACE的少，是因為據說大部分情況下，動物microRNA對RNA進行翻譯抑制，并不切斷RNA，也就不能做RACE了。

1、我自己會選250～1000。為的是跑膠和PCR都比較方便。檢驗一般不做吧，設計引物的時候注意和上游引 ...

你好，又有個問題需要向你請教一下，你做的時候有沒有對連接好接頭的RNA進行變性處理，在進行后續(xù)試驗啊？立體結構復雜的基因怎么定義的？謝謝~

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12樓2014-02-21 16:40:22

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引用回帖:

12樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-21 16:40:22
你好，又有個問題需要向你請教一下，你做的時候有沒有對連接好接頭的RNA進行變性處理，在進行后續(xù)試驗��？立體結構復雜的基因怎么定義的？謝謝~...

RNA連好接頭后直接按照逆轉錄酶的說明進行操作了。
你用試劑盒的話按試劑盒的做應該就可以了吧。逆轉錄前會有個高溫處理步驟吧？
我也不知道立體結構復雜的基因怎么定義。也許你可以用RNAstructure等程序分析一下你的RNA有沒有比較穩(wěn)定的二級結構。

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傲雪清霜

13樓2014-02-21 18:15:41

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6樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因組數據無所謂。但要有RNA數據，就是說，要知道m(xù)iRNA和（預測的）靶基因在你要研究的物種里的數據（這是顯而易見的，否則根本沒法設計引物）。

2、用預測軟件。植物的我用這個http://plantgrn.noble.org/p ...

你好最近在做植物miRNA的5'RACE 用的是TAKARA的試劑盒，擴增的條帶基本與自己預測到的是一致的，但測序的結果與預測的結果根本比不上是怎么回事啊請高手賜教

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14樓2014-02-23 16:13:23

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14樓: Originally posted by zhangxn at 2014-02-23 16:13:23
你好最近在做植物miRNA的5'RACE 用的是TAKARA的試劑盒，擴增的條帶基本與自己預測到的是一致的，但測序的結果與預測的結果根本比不上是怎么回事啊請高手賜教...

測序結果和你的目標基因完全對不上？是PCR產物直接測序？那就是非特異性擴增吧...
你的引物特異性好不好？做的是巢氏PCR吧？

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15樓2014-02-23 20:24:44

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你好，你有沒有做去磷酸化和去接頭那兩步��？我直接總RNA加接頭，結果outer PCR除了引物二聚體，嘛都沒有，今天又在做control了，看看是不是操作問題~

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16樓2014-02-24 09:52:50

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13樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-21 18:15:41
RNA連好接頭后直接按照逆轉錄酶的說明進行操作了。
你用試劑盒的話按試劑盒的做應該就可以了吧。逆轉錄前會有個高溫處理步驟吧？
我也不知道立體結構復雜的基因怎么定義。也許你可以用RNAstructure等程序分析一下 ...

你好，你驗證靶標時有沒有做去磷酸化和去接頭那兩步�。课抑苯涌俁NA加接頭，結果outer PCR除了引物二聚體，嘛都沒有，今天又在做control了，不知道是操作問題還是模版問題~

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17樓2014-02-24 11:25:03

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17樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-24 11:25:03
你好，你驗證靶標時有沒有做去磷酸化和去接頭那兩步啊？我直接總RNA加接頭，結果outer PCR除了引物二聚體，嘛都沒有，今天又在做control了，不知道是操作問題還是模版問題~...

沒有。第一輪PCR沒有也正常，第二輪PCR有就好。最好每次都做1個正對照以防操作或者試劑有問題。

我做得比較粗放：
提總RNA
直接取1ug，加接頭、酶等連接
直接取1uL連接物逆轉錄
直接取0.5uL逆轉錄物做PCR

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18樓2014-02-24 12:55:23

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18樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 12:55:23
沒有。第一輪PCR沒有也正常，第二輪PCR有就好。最好每次都做1個正對照以防操作或者試劑有問題。

我做得比較粗放：
提總RNA
直接取1ug，加接頭、酶等連接
直接取1uL連接物逆轉錄
直接取0.5uL逆轉錄物做PCR...

對哦，第一輪只跑了20個循環(huán)，表達量不高的話是看不到帶的，第二輪有帶了，都不太長，1000bp以下，切膠回收了，準備做連接。但是我搞不明白挑克隆怎么來說明靶標的某個位置是miRNA的切割位點，因為我們沒有去磷酸化，那理論上包含目的靶標序列的片段應該有很多才對，而我們切出來的帶應該是特定大小的DNA片段。參考文獻上6/10這樣的標志實際含義到底是什么��？是直接挑白斑測序看有沒有目的靶基因呢？還是包含完整靶標和不完整靶標的比例？我實在搞不明白這個原理，還有需不需要菌液PCR��？謝謝～

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19樓2014-02-25 13:09:07

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silicare: 回帖置頂 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代發(fā)): 金幣+50, 樓主獎勵 2014-02-25 17:35:55

引用回帖:

19樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-25 13:09:07
對哦，第一輪只跑了20個循環(huán)，表達量不高的話是看不到帶的，第二輪有帶了，都不太長，1000bp以下，切膠回收了，準備做連接。但是我搞不明白挑克隆怎么來說明靶標的某個位置是miRNA的切割位點，因為我們沒有去磷酸化 ...

如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話，我一般先切膠回收，用回收物重做一次PCR然后送去測序�？纯茨膫€條帶測序結果與實驗預期相符再做轉化，然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧：
這里不建議進行藍白斑篩選。因為5'RACE片段一般較短且在編碼區(qū)，該片段插入T載體后很可能（17 % ～ 100 %的概率）并不打斷LacZ基因的ORF，因而藍白斑篩選并無太大意義，反而可能使人選擇性地避開藍斑而漏檢部分有效的片段。

然后是5'RACE的一些原理，水平有限，僅作參考：
生物體內RNA由于受RISC切割等原因，會斷裂成截斷的片段。若想對切割的位點進行檢測，需要檢測出“3'端斷裂產物”的5'末端堿基序列，即可推測出切割位點，而這可以通過進行RLM-5'RACE實驗實現(xiàn)。理論上對“5'端斷裂產物”進行3'RACE能實現(xiàn)同樣的目的，但因為RNA一般從3'端開始降解，故對更穩(wěn)定的5'端進行RACE實驗更為合適。
檢測斷裂位點的RLM-5'RACE實驗步驟比檢測全長的5'RACE簡單，簡述如下：提取RNA，給RNA連上人工接頭，按常規(guī)流程進行逆轉錄，根據接頭序列及目標RNA的已知序列合成引物對逆轉錄產物進行PCR，PCR產物送測序，分析測序結果。
其中有以下細節(jié)需要了解：
接頭是否能順利連接？如何防止接頭的自連？RNA被RISC切割后，斷裂形成的5'端帶有Pi-基團，因此可以在RNA Ligase的作用下與人工合成的RNA接頭（單鏈RNA短片段）連接。人工合成的RNA接頭由于兩端都是OH-基團，不會發(fā)生自連，也不會與RNA的3'端連接。而且由于添加的RNA接頭是過量的，因此RNA斷裂片段間的連接可以忽略。綜上，可以保證連接產物絕大部分為“RNA接頭--斷裂的RNA片段”。
RNA接頭如何設計？接頭的設計并未找到什么指導原則，有興趣可以再翻翻文獻。但已知有以下幾點：商業(yè)化試劑盒里的接頭很少會形成發(fā)夾環(huán)或者二聚體結構，為保險起見自行設計時也應避免形成二級結構。接頭3'端應以AAA結尾，因為據文獻報道3'端為A能提高連接效率，連續(xù)三個A能保證即使接頭由于降解或合成缺陷而缺失一兩個堿基，末尾仍然是A。RNA接頭可以盡量長，以便在其上設計引物，但一般公司似乎只能合成45 nt，這也可以滿足實驗要求。
SMART-5'RACE并不適用于本實驗，因為該技術對斷裂的RNA片段不敏感，具體原因可以參看SMART RACE的說明書。至于其它RACE技術是否適用，需具體情況具體分析。

為什么5'RACE能說明miRNA對靶標RNA的切割？
體內RNA由于各種原因，常會在不同位點斷成長短不同的片段。假如一個RNA沒受到什么位點特異的機制對其降解，那么我們如果對其進行5'RACE，可以很合理地推測會檢測到很多不同大小的片段，而且這些片段的亮度應該都差不多。
但假如我們做完5'RACE以后發(fā)現(xiàn)，某個長度的片段（對應RNA某個位點的斷開事件）特別亮，那么我們就可以很合理地推測這個RNA似乎是受到某種位點特異的降解機制調控的。
假如幸運地發(fā)現(xiàn)，那個特別容易斷開的位點正好被預測是能與miRNA結合的，那么我們就可以很有把握地推測這個位點的斷開事件其實都是這個miRNA的功勞。

呃.....不過有意找茬的時候也可以說這只是巧合：
假如一條RNA 2000 nt；
假如在那上面預測到一個miRNA的結合位點；
假如由于隨機和巧合的原因，任意一條RNA上總有那么1~2個位點相對而言特別容易斷開；
那么這個特別容易斷開的位點正好位于預測的miRNA結合位點中間2個堿基上時的概率是1/（2000/2/2）=0.2%
這個概率不算大，但也并非完全沒有可能。

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20樓2014-02-25 16:34:08

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