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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

★ ★ ★
傲雪清霜(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-08-15 12:58:41
引用回帖:
30樓: Originally posted by cfl88gupan at 2014-03-09 11:12:43
novel 是指新發(fā)現(xiàn)的microRNA序列,數(shù)據(jù)庫里沒有的,“mature若干”是指數(shù)據(jù)庫里面有的有很多,挑了4個做了驗證microRNA是否真的存在于我的材料里面的這個實驗(公司給的結(jié)果假陽性很多的),選的時候條件是:是否與 ...

明白了。
你的驗證實驗是做Northern嗎?
會不會由于實驗本身比較難做導致你沒做出來?
加入實驗的結(jié)果是可靠的,會不會因為實驗本身敏感度較低,或者你的材料里microRNA豐度較低使你沒有檢測出?

假如你已經(jīng)從測序數(shù)據(jù)里選了一個片段數(shù)目相當而且經(jīng)過前人驗證的miRNA作為驗證實驗的正對照,那么你的目標沒檢測出確實是個比較奇怪的結(jié)果。
這里我只想到兩種解釋:
驗證實驗用的材料與測序用的材料不一致;
測序結(jié)果不可靠,或者需要進一步篩選。
31樓2014-03-09 12:34:04
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感謝真實

銀蟲 (初入文壇)

引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

您好,您說的這個5‘RACE,兩端引物分別是什么?我只知道RACE是擴全長用的,現(xiàn)在您和其他人都在講的這個斷裂位點,我很困惑。引物是5’的反向互補,另一條呢,來自預測的miRNA??不是結(jié)合3‘-UTR么,為什么都要擴5’?希望大神能給俺答疑解惑,真心想的頭大
畢業(yè)了~實驗繼續(xù)
32樓2014-08-15 10:55:13
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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
32樓: Originally posted by 感謝真實 at 2014-08-15 10:55:13
您好,您說的這個5‘RACE,兩端引物分別是什么?我只知道RACE是擴全長用的,現(xiàn)在您和其他人都在講的這個斷裂位點,我很困惑。引物是5’的反向互補,另一條呢,來自預測的miRNA??不是結(jié)合3‘-UTR么,為什么都要擴 ...

首先,沒什么能規(guī)定miRNA必須結(jié)合3' UTR。
然后,這里討論的是那種通過切斷靶標起作用的miRNA。
針對這種情況,我們通過檢測候選靶標的預測結(jié)合位點是否出現(xiàn)大量斷裂物來判斷其是否受到miRNA的作用。
既然是斷裂物,用RLM-RACE技術(shù)檢測5'末端或者3'末端就能實現(xiàn)檢測目的。
為什么要用5'RACE?據(jù)說5'斷口比較穩(wěn)定。
那么引物是怎么來的?一條來自接頭序列,一條來自靶標RNA。你看看RLM-RACE的原理就明白了。
33樓2014-08-15 21:21:45
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wlf200501

新蟲 (正式寫手)


引用回帖:
7樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-19 15:13:15
謝謝,確實如你所說,動物中很少用RACE的,我找到的文獻大多是植物相關(guān)的,可能跟動物miRNA靶點較多有關(guān)。還有幾個問題不是很明白,希望得到你的指點~

1.我在相應的轉(zhuǎn)錄組找到了miRNA與其靶點的結(jié)合處,上游正 ...

你好,不知道您現(xiàn)在race做的怎么樣了,我做的是植物方向miRNA,老師要求做靶基因驗證,準備花7000塊 買只能用十次的 clontech的盒子。感覺壓力大,網(wǎng)上都說不好做。想好好請教您一下,我也聯(lián)系@XOooZzz了,但是還沒回復我,相對比較著急,呵呵 所以。。。。希望理解。能加您一下QQ嗎,或者您加我31789632
34樓2014-12-16 18:27:01
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wlf200501

新蟲 (正式寫手)


引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

你好,您說smart—5‘race不適合miRNA靶基因驗證,我剛想買clontech 的SMARTer® RACE 5’/3’ Kit盒子。是不是不太好,我做的是大豆材料的5‘race。之前對降解組進行了,t-plot分析。預測的應該沒問題,剩下就是做驗證了。麻煩您不吝賜教,謝謝了。
35樓2014-12-23 10:04:15
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wenchaohee

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

說的太好了!贊!
36樓2015-01-25 12:45:04
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cold_blood

金蟲 (小有名氣)

需要做降解組測序嗎?
生活,不是看你有什么,而是看你要什么。
37樓2015-10-12 23:22:07
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koala0224

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

大俠,你好,我也是做驗證靶基因位點,看文獻好些都是ABI的試劑盒做的,那試劑盒要7500塊,老板嫌貴了,而且我也是主要用到RNA接頭,其余試劑暫時用不到,買了也不劃算。我想著用試劑盒說明里給出的RNA接頭序列讓試劑公司來合成。我看你說你做驗證也沒有用試劑盒,那你用的RNA接頭是自己合成的嗎?這個接頭合成有什么講究嗎?有什么結(jié)構(gòu)上的要求嗎?合成后直接用T4RNA連接酶連接就可以了嗎?下面的是接頭序列。先謝謝哦。
5' RACE Adapter (0.3 μg/μL)        5'-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3'
38樓2016-05-21 09:28:57
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yantaowang

金蟲 (正式寫手)

奮斗小青年

引用回帖:
6樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因組數(shù)據(jù)無所謂。但要有RNA數(shù)據(jù),就是說,要知道m(xù)iRNA和(預測的)靶基因在你要研究的物種里的數(shù)據(jù)(這是顯而易見的,否則根本沒法設計引物)。

2、用預測軟件。植物的我用這個http://plantgrn.noble.org/p ...

您好,我最近也在做5‘-Race,驗證miRNA靶基因的切割位點,提取RNA后,加5’接頭序列,用的是Takara的T4 RNA連接酶,過夜后反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。采用touch-Down PCR進行擴增,能夠看到有條帶,回收后發(fā)現(xiàn)是26 S rRNA序列,還有一個是我研究的物種的序列,但都不是目的序列,我想問一下,這樣的結(jié)果是由于我的基因特異性引物2的特異性不強所導致的嗎?我接下來是需要重新設計引物擴增,那該如何避免出現(xiàn)類似的情況,如果不是的話,我又該怎樣改進我的實驗呢。謝謝!
我生命里的溫暖就那么多......全部給了你!
39樓2016-12-30 13:40:46
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曲右將軍

銀蟲 (初入文壇)

引用回帖:
6樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因組數(shù)據(jù)無所謂。但要有RNA數(shù)據(jù),就是說,要知道m(xù)iRNA和(預測的)靶基因在你要研究的物種里的數(shù)據(jù)(這是顯而易見的,否則根本沒法設計引物)。

2、用預測軟件。植物的我用這個http://plantgrn.noble.org/p ...

求教!我的情況是基因啟動子加上GUS,染色出來根里表達高,但是基因在根里表達特別低,懷疑是miRNA切割了,但是擴增不出來,請問我選擇樣品RNA時要考慮基因RNA的表達量嗎?
40樓2018-01-12 15:01:29
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