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傲雪清霜

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預(yù)期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

感激之情不以言表,是我查詢很久對RLM-5'RACE原理最詳細的說明,感謝XOooZzz蟲友的熱心答復(fù),也感謝小木蟲這個平臺^_^!
有時候我可以理解這個世界,有時候又什么都不懂~
21樓2014-02-25 18:33:40
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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
21樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-25 18:33:40
感激之情不以言表,是我查詢很久對RLM-5'RACE原理最詳細的說明,感謝XOooZzz蟲友的熱心答復(fù),也感謝小木蟲這個平臺^_^!...

哦,不用客氣,也就粘貼了一下以前的東西.
22樓2014-02-25 19:01:14
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傲雪清霜

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
20樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-25 16:34:08
如果條帶很多又分不清哪個是目標條帶的話,我一般先切膠回收,用回收物重做一次PCR然后送去測序?纯茨膫條帶測序結(jié)果與實驗預(yù)期相符再做轉(zhuǎn)化,然后挑10個克隆再測序。
我翻翻以前的文字....貼下面吧:
這里不建 ...

你好,為嘛膠回收后跑膠驗證是單一目的條帶,但以此為模板在進行PCR又會出現(xiàn)雜帶?如果主條帶比目的條帶亮很多的話,可不可以直接PCR產(chǎn)物測序?
有時候我可以理解這個世界,有時候又什么都不懂~
23樓2014-02-26 13:38:27
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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
23樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-26 13:38:27
你好,為嘛膠回收后跑膠驗證是單一目的條帶,但以此為模板在進行PCR又會出現(xiàn)雜帶?如果主條帶比目的條帶亮很多的話,可不可以直接PCR產(chǎn)物測序?...

引物特異性不好?或者回收時夾雜了一些別的片段?
你的意思是主條帶不是目的條帶?而且主條帶很亮?
直接PCR產(chǎn)物測序可以看看你選的測序公司的要求呃,有的可以,有的要求沒有雜帶.
雜帶很多的話試試直接連T載體送菌落測序
24樓2014-02-26 15:51:26
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傲雪清霜

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
24樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-26 15:51:26
引物特異性不好?或者回收時夾雜了一些別的片段?
你的意思是主條帶不是目的條帶?而且主條帶很亮?
直接PCR產(chǎn)物測序可以看看你選的測序公司的要求呃,有的可以,有的要求沒有雜帶.
雜帶很多的話試試直接連T載體 ...

主條帶是目的條帶很亮,但是還有其他肉眼可見條帶,華大測的,據(jù)說可以。
最后挑好的單克隆直接測序就好了吧?如果菌液PCR后測序貌似沒多大意思?
之前的問題你回答的很詳細,可能由于我沒有表述清楚,有個細節(jié)我不明白:
包含目的條帶的PCR產(chǎn)物應(yīng)該不止一條,是先把該PCR產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化,挑克隆,
然后菌液PCR挑選有條帶(此處的條帶應(yīng)該大小不同)的菌液去測序找切割位點,然
后統(tǒng)計切割率?
還是PCR后把比較明亮的帶都切下來分別膠回收,以回收后的產(chǎn)物去連接轉(zhuǎn)化挑克隆,
從中挑選一定數(shù)量的白斑去測序,計算測到切割條帶和其他情況的比率(包括假陽性)?
我覺得貌似第一種理解更合理,
有時候我可以理解這個世界,有時候又什么都不懂~
25樓2014-02-26 16:26:08
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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

★ ★ ★ ★ ★
傲雪清霜(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵熱心回帖交流 2014-08-15 12:59:02
引用回帖:
25樓: Originally posted by 傲雪清霜 at 2014-02-26 16:26:08
主條帶是目的條帶很亮,但是還有其他肉眼可見條帶,華大測的,據(jù)說可以。
最后挑好的單克隆直接測序就好了吧?如果菌液PCR后測序貌似沒多大意思?
之前的問題你回答的很詳細,可能由于我沒有表述清楚,有個細節(jié)我 ...

我也覺得第一種合理,不過我會照第二種去做...
為什么呢...先看個降解組數(shù)據(jù)吧。不了解降解組的話可以自己google一下,這里可以簡單地理解為按照你所說的第一種方法做5'RACE,然后挑了成千上萬個克隆去測序。然后在RNA上把各個位點檢測到的克隆數(shù)標出,如下圖(這是水稻中某個受mir393調(diào)控的基因,識別位點是2220附近)。
5‘Race驗證miRNA靶點的原理
圖中2220附近有一個峰,數(shù)值是196(圖中未列出),意即有196個克隆檢測到5'末端是2220這點。但假如你是在2500的地方的設(shè)計引物,那么2500之前所有點的總和是1029。就是說按照你說的第一種方法挑10個克隆測序,運氣好可能會檢測到兩三個(平均196/1029個)目標位點的克隆,運氣稍不好就檢測不到目標克隆了。

這樣的話你怎么解釋實驗結(jié)果呢(上文下劃線部分)?是該認為該基因受mir393調(diào)控的證據(jù)比較弱?
但如果再看回降解組數(shù)據(jù)的圖,其實受調(diào)控的證據(jù)是很強的。
所以我會按你說的第二種方法做咯。


按第二種方法的話,一開始是分別切下有希望的幾條帶,回收連T載體轉(zhuǎn)化挑10個克隆測序。
后來發(fā)現(xiàn)有些條帶是非特異性擴增,也有單引物擴增,有些條帶并不對應(yīng)我的目的位點。于是后來就先回收產(chǎn)物重復(fù)PCR,測序,排除不想要的。再挑那個目的條帶回收連T載體轉(zhuǎn)化挑10個克隆測序。
畢竟我只要說明這么多條帶里面有一條是對應(yīng)我的目的位點就可以了。
26樓2014-02-26 21:21:33
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cfl88gupan

金蟲 (正式寫手)

引用回帖:
6樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 09:08:42
1、基因組數(shù)據(jù)無所謂。但要有RNA數(shù)據(jù),就是說,要知道m(xù)iRNA和(預(yù)測的)靶基因在你要研究的物種里的數(shù)據(jù)(這是顯而易見的,否則根本沒法設(shè)計引物)。

2、用預(yù)測軟件。植物的我用這個http://plantgrn.noble.org/p ...

這位大神,特愿請教您一個問題,我將材料送到公司(貝瑞和康)去測序了,得到了817個novel的序列以及mature的若干,關(guān)鍵在于這817個,我覺得數(shù)據(jù)太大了,很難相信啊,挑了四個做之后,一個也沒有做成功,不知道后面該怎么下去,能否提供點意見啊  謝謝咯
你還行的
27樓2014-03-08 16:10:35
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XOooZzz

銀蟲 (小有名氣)

引用回帖:
27樓: Originally posted by cfl88gupan at 2014-03-08 16:10:35
這位大神,特愿請教您一個問題,我將材料送到公司(貝瑞和康)去測序了,得到了817個novel的序列以及mature的若干,關(guān)鍵在于這817個,我覺得數(shù)據(jù)太大了,很難相信啊,挑了四個做之后,一個也沒有做成功,不知道后面 ...

大神不敢當(dāng),其實我也不是很懂的...而且估計以后也不做這個了
高通量測序什么的我沒做過,也不太懂.
你所說的novel序列是指新發(fā)現(xiàn)的成熟microRNA序列嗎?那么“mature若干”是什么意思?挑了4個做的是什么實驗?怎么選的這4個?
水平有限,未必能幫到你。不介意的話希望你說詳細點大家討論討論。
28樓2014-03-08 19:35:16
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音四1990

鐵蟲 (小有名氣)

我用過ROCHE和SUPERSWITCH的RACE Kit 但是都好貴 老師推薦我買的全式金的酶 那個比進口便宜跑出來效果也沒差
我沒那種命啊輪也不會輪到我
29樓2014-03-09 09:33:31
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cfl88gupan

金蟲 (正式寫手)

引用回帖:
28樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-08 19:35:16
大神不敢當(dāng),其實我也不是很懂的...而且估計以后也不做這個了
高通量測序什么的我沒做過,也不太懂.
你所說的novel序列是指新發(fā)現(xiàn)的成熟microRNA序列嗎?那么“mature若干”是什么意思?挑了4個做的是什么實驗? ...

novel 是指新發(fā)現(xiàn)的microRNA序列,數(shù)據(jù)庫里沒有的,“mature若干”是指數(shù)據(jù)庫里面有的有很多,挑了4個做了驗證microRNA是否真的存在于我的材料里面的這個實驗(公司給的結(jié)果假陽性很多的),選的時候條件是:是否與抗逆相關(guān)和片段數(shù)目(公司給的數(shù)據(jù)里面有)。高通量測序是指將材料交給公司,然后讓他們進行microRNA全部的測序。不知道說明白否?
你還行的
30樓2014-03-09 11:12:43
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