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5‘Race驗(yàn)證miRNA靶點(diǎn)的原理 已有2人參與
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大家好，近期內(nèi)急需做驗(yàn)證miRNA靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)，考慮要用RACE，但是首次接觸，感覺很多問題想不明白， 頭都要漲破了，于是在自己繼續(xù)摸索的同時(shí)，想請(qǐng)有這方面經(jīng)驗(yàn)的蟲友賜教，先表示感謝  1.我研究的物種是一個(gè)基因組沒測(cè)過序的，但有其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組，這樣可否進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證？ 2.如果可以，那么動(dòng)物miRNA怎么在對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本里找尋相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)序列（種子序列完全互補(bǔ)？其余序列 允許幾個(gè)錯(cuò)配？大概需要上下幾kb?）？ 3.miRNA應(yīng)該跟mRNA 3‘UTR結(jié)合，那為什么要用5’RACE (主要是擴(kuò)5‘UTR)，而不是用3’URT？是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄 出來(lái)的cDNA跟實(shí)際的mRNA是互補(bǔ)的嗎？如果是這樣，那么特異性引物設(shè)計(jì)的時(shí)候應(yīng)該是跟mRNA序列一致 的而非反向互補(bǔ)吧。 4.具體試劑盒考慮買Takara的，不知道其效果怎樣？大概多久能出結(jié)果？ 5.有沒有動(dòng)物中做5‘RACE驗(yàn)證miRNA靶標(biāo)相關(guān)的文獻(xiàn)可以推薦？ 這些問題時(shí)本人懷著極其虔誠(chéng)而又焦慮的心情寫下的，怕寫少了，見這不明所以；寫的多了，又覺啰嗦，請(qǐng)親們不吝賜教吧！ 搬個(gè)小板凳在線等~~~  : |
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silicare: 回帖置頂 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代發(fā)): 金幣+50, 樓主獎(jiǎng)勵(lì) 2014-02-25 17:35:55
silicare: 回帖置頂 2014-02-25 17:35:36
傲雪清霜(silicare代發(fā)): 金幣+50, 樓主獎(jiǎng)勵(lì) 2014-02-25 17:35:55
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如果條帶很多又分不清哪個(gè)是目標(biāo)條帶的話，我一般先切膠回收，用回收物重做一次PCR然后送去測(cè)序�？纯茨膫�(gè)條帶測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符再做轉(zhuǎn)化，然后挑10個(gè)克隆再測(cè)序。 我翻翻以前的文字....貼下面吧： 這里不建議進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。因?yàn)?'RACE片段一般較短且在編碼區(qū)，該片段插入T載體后很可能（17 % ～ 100 %的概率）并不打斷LacZ基因的ORF，因而藍(lán)白斑篩選并無(wú)太大意義，反而可能使人選擇性地避開藍(lán)斑而漏檢部分有效的片段。 然后是5'RACE的一些原理，水平有限，僅作參考： 生物體內(nèi)RNA由于受RISC切割等原因，會(huì)斷裂成截?cái)嗟钠�。若想�?duì)切割的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，需要檢測(cè)出“3'端斷裂產(chǎn)物”的5'末端堿基序列，即可推測(cè)出切割位點(diǎn)，而這可以通過進(jìn)行RLM-5'RACE實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。理論上對(duì)“5'端斷裂產(chǎn)物”進(jìn)行3'RACE能實(shí)現(xiàn)同樣的目的，但因?yàn)镽NA一般從3'端開始降解，故對(duì)更穩(wěn)定的5'端進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)更為合適。 檢測(cè)斷裂位點(diǎn)的RLM-5'RACE實(shí)驗(yàn)步驟比檢測(cè)全長(zhǎng)的5'RACE簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)述如下：提取RNA，給RNA連上人工接頭，按常規(guī)流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)接頭序列及目標(biāo)RNA的已知序列合成引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物送測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果。 其中有以下細(xì)節(jié)需要了解： 接頭是否能順利連接？如何防止接頭的自連？RNA被RISC切割后，斷裂形成的5'端帶有Pi-基團(tuán)，因此可以在RNA Ligase的作用下與人工合成的RNA接頭（單鏈RNA短片段）連接。人工合成的RNA接頭由于兩端都是OH-基團(tuán)，不會(huì)發(fā)生自連，也不會(huì)與RNA的3'端連接。而且由于添加的RNA接頭是過量的，因此RNA斷裂片段間的連接可以忽略。綜上，可以保證連接產(chǎn)物絕大部分為“RNA接頭--斷裂的RNA片段”。 RNA接頭如何設(shè)計(jì)？接頭的設(shè)計(jì)并未找到什么指導(dǎo)原則，有興趣可以再翻翻文獻(xiàn)。但已知有以下幾點(diǎn)：商業(yè)化試劑盒里的接頭很少會(huì)形成發(fā)夾環(huán)或者二聚體結(jié)構(gòu)，為保險(xiǎn)起見自行設(shè)計(jì)時(shí)也應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。接頭3'端應(yīng)以AAA結(jié)尾，因?yàn)閾?jù)文獻(xiàn)報(bào)道3'端為A能提高連接效率，連續(xù)三個(gè)A能保證即使接頭由于降解或合成缺陷而缺失一兩個(gè)堿基，末尾仍然是A。RNA接頭可以盡量長(zhǎng)，以便在其上設(shè)計(jì)引物，但一般公司似乎只能合成45 nt，這也可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。 SMART-5'RACE并不適用于本實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵摷夹g(shù)對(duì)斷裂的RNA片段不敏感，具體原因可以參看SMART RACE的說(shuō)明書。至于其它RACE技術(shù)是否適用，需具體情況具體分析。 為什么5'RACE能說(shuō)明miRNA對(duì)靶標(biāo)RNA的切割？ 體內(nèi)RNA由于各種原因，常會(huì)在不同位點(diǎn)斷成長(zhǎng)短不同的片段。假如一個(gè)RNA沒受到什么位點(diǎn)特異的機(jī)制對(duì)其降解，那么我們?nèi)绻麑?duì)其進(jìn)行5'RACE，可以很合理地推測(cè)會(huì)檢測(cè)到很多不同大小的片段，而且這些片段的亮度應(yīng)該都差不多。 但假如我們做完5'RACE以后發(fā)現(xiàn)，某個(gè)長(zhǎng)度的片段（對(duì)應(yīng)RNA某個(gè)位點(diǎn)的斷開事件）特別亮，那么我們就可以很合理地推測(cè)這個(gè)RNA似乎是受到某種位點(diǎn)特異的降解機(jī)制調(diào)控的。 假如幸運(yùn)地發(fā)現(xiàn)，那個(gè)特別容易斷開的位點(diǎn)正好被預(yù)測(cè)是能與miRNA結(jié)合的，那么我們就可以很有把握地推測(cè)這個(gè)位點(diǎn)的斷開事件其實(shí)都是這個(gè)miRNA的功勞。 呃.....不過有意找茬的時(shí)候也可以說(shuō)這只是巧合： 假如一條RNA 2000 nt； 假如在那上面預(yù)測(cè)到一個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)； 假如由于隨機(jī)和巧合的原因，任意一條RNA上總有那么1~2個(gè)位點(diǎn)相對(duì)而言特別容易斷開； 那么這個(gè)特別容易斷開的位點(diǎn)正好位于預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)中間2個(gè)堿基上時(shí)的概率是1/（2000/2/2）=0.2% 這個(gè)概率不算大，但也并非完全沒有可能。 |
20樓2014-02-25 16:34:08
【答案】應(yīng)助回帖
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傲雪清霜: 金幣+28, ★★★很有幫助, 很有用的答復(fù)，謝謝你的熱心回答^_^～ 2014-02-19 14:55:59
gyesang: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-02-19 17:19:18
gyesang: 回帖置頂 2014-02-23 23:49:08
傲雪清霜: 金幣+28, ★★★很有幫助, 很有用的答復(fù)，謝謝你的熱心回答^_^～ 2014-02-19 14:55:59
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gyesang: 回帖置頂 2014-02-23 23:49:08
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1、基因組數(shù)據(jù)無(wú)所謂。但要有RNA數(shù)據(jù)，就是說(shuō)，要知道m(xù)iRNA和（預(yù)測(cè)的）靶基因在你要研究的物種里的數(shù)據(jù)（這是顯而易見的，否則根本沒法設(shè)計(jì)引物）。 2、用預(yù)測(cè)軟件。植物的我用這個(gè)http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3，操作很簡(jiǎn)單。動(dòng)物的你自己找找吧，照理說(shuō)動(dòng)物的資源比植物的多得多。 3、引物斷裂物的5'末端比較穩(wěn)定。5'RACE只是指擴(kuò)展5'端，不特指擴(kuò)5'UTR。特異引物設(shè)計(jì)應(yīng)與mRNA序列反向互補(bǔ)。這與cDNA和mRNA是否互補(bǔ)沒有關(guān)系，這個(gè)必須搞明白，請(qǐng)仔細(xì)回顧一下PCR的過程。 4、試劑盒沒用過，應(yīng)該都無(wú)問題。運(yùn)氣好，第一天提RNA，連RNA接頭；第二天逆轉(zhuǎn)錄，做巢式PCR，跑膠回收目的條帶；第三天測(cè)序；第四天分析結(jié)果......運(yùn)氣好的話。 5、我做植物的，不知道。印象中5'RACE實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物中不是主流。 問題寫多了好，啰嗦總比使人莫名其妙強(qiáng)。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
6樓2014-02-19 09:08:42
送紅花一朵 |
謝謝，確實(shí)如你所說(shuō)，動(dòng)物中很少用RACE的，我找到的文獻(xiàn)大多是植物相關(guān)的，可能跟動(dòng)物miRNA靶點(diǎn)較多有關(guān)。還有幾個(gè)問題不是很明白，希望得到你的指點(diǎn)～ 1.我在相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組找到了miRNA與其靶點(diǎn)的結(jié)合處，上游正向引物試劑盒自帶的，下游特異性引物應(yīng)該設(shè)在這個(gè)結(jié)合點(diǎn)后大約多少bp？有沒有專門檢驗(yàn)自己設(shè)的特異性引物跟試劑盒已知引物是否適合？ 2.最后巢式PCR跑出幾條帶正常？挑克隆時(shí)是挑哪條帶？5'RACE目的是擴(kuò)基因的5'全長(zhǎng)，貌似跟RACE驗(yàn)證miRNA的原理有些差異，但我想不明白？能否給我解釋一下？ 萬(wàn)分感激～ |
7樓2014-02-19 15:13:15
10樓2014-02-19 17:03:42
kaixinla168
銀蟲 (正式寫手)
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2樓2014-02-17 08:25:56
，謝謝看帖，送個(gè)小紅花 3樓2014-02-17 17:47:16
yipan 
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-02-18 11:47:22
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
傲雪清霜(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-02-18 11:47:22
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轉(zhuǎn)錄組是指某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一生理功能狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄的mRNA產(chǎn)物的集合，包含了時(shí)間和空間的限定，是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調(diào)控方式。 應(yīng)用高通量技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種快捷可靠的獲取轉(zhuǎn)錄組信息的方法。派森諾生物提供mRNA的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分析，通過獲得研究對(duì)象基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的信息，鑒定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn)，可變剪切等，其精確的計(jì)數(shù)方法更可對(duì)基因進(jìn)行精確的定量分析。 一、技術(shù)路線 轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序包含兩部分內(nèi)容：①有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(Transcriptome analysis with reference genome)；②無(wú)參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析(De novotranscriptome analysis)。 1、有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)路線 優(yōu)選平臺(tái)：Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)采用雙端測(cè)序方法，單次測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)量大，能夠得到更高的覆蓋深度，檢測(cè)更多低豐度的轉(zhuǎn)錄本。Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)操作靈活，不需要跟別的樣本湊足一個(gè)Run，只要您的樣品準(zhǔn)備好了，平臺(tái)馬上能為您運(yùn)行。 派森諾生物Illumina 測(cè)序平臺(tái)結(jié)合成熟的生物信息學(xué)分析系統(tǒng)，是基因組序列已知物種的轉(zhuǎn)錄組分析的最佳選擇。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機(jī)引物cDNA合成 上機(jī)測(cè)序 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學(xué)分析 高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù) 2、無(wú)參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析 優(yōu)選平臺(tái)：在Roche 454 FLX基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的Roche 454 FLX+，有著成熟的分析軟件和分析流程，具有長(zhǎng)度長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，易于后續(xù)拼接和生物信息分析，提供最接近轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。 總RNA樣品 mRNA富集 片段化mRNA 隨機(jī)引物cDNA合成 454 FLX+上機(jī)測(cè)序 De novo組裝 數(shù)據(jù)質(zhì)控 生物信息學(xué)分析 高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù) 二、生物信息學(xué)分析 1）有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理 b)map到基因組 c)基因組注釋整理及表達(dá)量分析 d)表達(dá)差異分析 e)表達(dá)差異GO聚類分析 f)基因覆蓋分析 g)SNP分析 h)KEGG pathway分析 i)可變剪切分析 j)基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及新基因發(fā)現(xiàn) 2）無(wú)參考基因組的轉(zhuǎn)錄組 a)原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理 b)Contig和Unigene統(tǒng)計(jì)分析 c)Unigene功能注釋 d)表達(dá)差異分析 e)表達(dá)差異GO聚類分析 f)KEGG pathway分析 g)SNP分析 h)SSR分析 三、 常見問題解答 1、Q: 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與其他方法相比有哪些優(yōu)勢(shì)？ A: 相對(duì)于傳統(tǒng)芯片而言，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用范圍廣，無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)探針或了解物種的基因信息，即可對(duì)任意物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，能夠提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，同時(shí)能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，預(yù)測(cè)新的基因，檢測(cè)可變剪切，SNPs，融合基因等，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具。 技術(shù) 芯片技術(shù) cDNA/EST測(cè)序 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 手段 雜交 一代測(cè)序 二代測(cè)序 分辨率 ＜100bp 單個(gè)堿基 單個(gè)堿基 通量 較高 低 高 是否依賴參考序列 是 否 否 背景噪音 強(qiáng) 弱 弱 檢測(cè)靈敏度 低 高 高 需提供的RNA總量 高 高 低 2、Q: 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有哪些注意事項(xiàng)？ A: 1)RNA的質(zhì)量好壞會(huì)嚴(yán)重影響測(cè)序的質(zhì)量： ①RNA的3’端發(fā)生降解，則無(wú)法通過3’端的poly A尾捕獲mRNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行測(cè)序也無(wú)法得到全部的cDNA； ②若RNA的5’端發(fā)生降解，即使通過3’端的poly A捕獲得到mRNA，測(cè)序結(jié)果也將出現(xiàn)明顯的3’和5’偏向性。 2)若RNA濃度較低時(shí)，也會(huì)影響測(cè)序的質(zhì)量。可通過增加PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的方法獲得足夠的量用于后續(xù)測(cè)序。 3)測(cè)序信號(hào)和準(zhǔn)確性會(huì)因文庫(kù)中poly A多聚物的存在發(fā)生一定的偏差。 3、Q: 如何進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄組分析？ A: 針對(duì)原核生物的mRNA沒有poly A尾巴的情況，需要提供純化后的原核生物mRNA或cDNA樣品。 4、Q: 對(duì)于有參考基因組序列和沒有參考基因組序列的情況，派森諾生物曾做過哪些物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析？ A: 派森諾生物已與國(guó)內(nèi)外多個(gè)知名的高校與研究所開展了多種模式生物及主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)錄組分析，例如玉米、雞和人等十幾個(gè)物種，從這些轉(zhuǎn)錄組的分析研究中發(fā)現(xiàn)了很多新結(jié)構(gòu)、新基因，派森諾生物也做過多種無(wú)參考基因組物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，包括鵝，綠藻等，為這些物種的深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)。 5、Q: 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要多少測(cè)序量？ A: 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需的測(cè)序量隨物種轉(zhuǎn)錄組大小的不同而有所差異。而轉(zhuǎn)錄組的大小受基因數(shù)目和豐度雙重影響，不同物種間變化很大。因此在測(cè)序之前，需要對(duì)轉(zhuǎn)錄組的大小進(jìn)行評(píng)估。①針對(duì)有參考基因組的物種，可通過分析基因組信息，統(tǒng)計(jì)編碼基因個(gè)數(shù)及其堿基數(shù)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)錄組的大小，同時(shí)也可參考相近或相關(guān)物種轉(zhuǎn)錄組研究的文章；②針對(duì)無(wú)參考基因組的物種，只能參考相近物種的轉(zhuǎn)錄組大小。 |
4樓2014-02-18 10:40:11
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5樓2014-02-19 02:28:36
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動(dòng)物做RACE的少，是因?yàn)閾?jù)說(shuō)大部分情況下，動(dòng)物microRNA對(duì)RNA進(jìn)行翻譯抑制，并不切斷RNA，也就不能做RACE了。 1、我自己會(huì)選250～1000。為的是跑膠和PCR都比較方便。檢驗(yàn)一般不做吧，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候注意和上游引物匹配就ok了。 2、無(wú)論跑出幾條帶都正常....如果你的實(shí)驗(yàn)假設(shè)正確的話，那至少應(yīng)該看到有預(yù)測(cè)長(zhǎng)度的產(chǎn)物，把這條產(chǎn)物切下來(lái)分別測(cè)序就可以。為保險(xiǎn)起見可以把目標(biāo)產(chǎn)物附近的條帶也切下來(lái)測(cè)序。 要驗(yàn)證動(dòng)物靶RNA的話還是多準(zhǔn)備后路吧，譬如說(shuō)把預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)連到熒光蛋白，看熒光蛋白的表達(dá)會(huì)不會(huì)被miRNA抑制什么的。 |
8樓2014-02-19 16:12:24
9樓2014-02-19 16:28:07
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