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[求助]
連接時(shí)載體去磷 已有3人參與
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載體和目的片段鏈接的時(shí)候，因?yàn)檩d體自連，陽(yáng)性很少，所以用堿性磷酸酶處理載體去磷，再和目的片段連接，以提高連接效率。 我想問一下，去磷的反應(yīng)條件是什么，然后怎么把載體上的磷酸酶去掉終止反應(yīng)，80度反應(yīng)20分鐘會(huì)不會(huì)讓DNA雙鏈開環(huán)，還有沒有其他方法？連接時(shí)目的片段怎么處理？PCR回收后就可以用T4連接酶連了嗎？ |
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zhang宇微5樓2014-02-19 20:13:59
gyesang
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去磷酸化的條件嚴(yán)格按照你所使用的去磷酸化的說(shuō)明書來(lái)，不同的去磷酸酶反應(yīng)條件不一樣，不同公司的酶也略有不同，但每種酶每個(gè)公司都會(huì)有自己的產(chǎn)品說(shuō)明書和使用說(shuō)明書 你要先做去磷酸化處理，你是單酶切載體的嗎？如果是雙酶切的話，就用不著去磷酸化 目的片段PCR回收后，要看你連什么載體，如果是連目標(biāo)載體，你的片段需要用你設(shè)計(jì)的相關(guān)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切然后和載體進(jìn)行連接 |
2樓2014-02-19 17:27:42
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一般來(lái)說(shuō)，載體去磷酸化不好掌握。如果不用盡量不用。 http://www.51atgc.com/shiyanjish ... 0-01-17/1226_2.html |
3樓2014-02-19 17:28:15
shiyiyaya
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我們?nèi)チ椎臅r(shí)候用SAP，小牛磷酸酶等，他們都有對(duì)應(yīng)的buffer，也是按照說(shuō)明書做的。滅活的時(shí)候65°C即可，20min。 直接膠回收，回收柱的那種簡(jiǎn)單回收，去掉鹽離子就行。后續(xù)連接正常。 祝順利！ |
4樓2014-02-19 17:45:39
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