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seo.d_park木蟲 (正式寫手)
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[求助]
關于Cloning的問題，求救啊~~ 已有5人參與
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我在做的cloning， 我的幾個mutant...Ligation,enzyme cutting 確認, sequencing, Protein expression這些都沒有問題。 所以準備做Maxi prep來大量提取DNA。 但是問題就出在這兒。 之前的步驟一直是拿取的colony 在4ml LB broth培養(yǎng)(3ml培養(yǎng)，1ml做了Stock)后，Mini prep提取的DNA做的。 然后確定DNA沒問題后，拿stock做 Maxi prep。 (stock是 菌液：DMSO=4:1 制作的 500ul,然后放入-80℃的freezer 冷凍保管。) 在做Maxi 時候（確認培養(yǎng)液渾濁后），取少量(3ml)又用restriction enzyme 切了一遍，發(fā)現(xiàn)沒有之前(Colony提取的DNA) Insert band 明顯(DNA量加到2ug才能隱約看到Insert band,有幾個根本看不到，之前用1ug 就能看到明顯的insert band，我所做的Insert size 是200~700bp，restriction enzyme 前后端一起切的,用的是takara的，1ug/1ug）。 然后繼續(xù)確認了Protein expression，與之前一樣用了1ug 進行了transfection,但是沒有出現(xiàn)Band。 所以我又疑惑把Maxi prep提取的DNA切了一遍，insert這次根本切不掉了。 這到底是什么問題啊。。 不可能是在培養(yǎng)過程中變異或者在freezer里面變異了吧。。。 求解啊~~  上面的圖是1ug cutting,下面的是2ug...colony cutting(下面的Band).jpg stock cutting(下數(shù)第二個band).jpg |
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