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倩女金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
siRNA轉(zhuǎn)染過(guò)程中，用10%FBS培養(yǎng)基會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎 已有2人參與
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最近在做細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染，之前實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)染過(guò)程中都用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24h，然后再換10%FBS培養(yǎng)基。因?yàn)槲业募?xì)胞在無(wú)血清條件下，狀態(tài)不好，會(huì)縮小，所以沒(méi)有用無(wú)血清培養(yǎng)基，直接采用的是10%FBS，目前出現(xiàn)的問(wèn)題就是，細(xì)胞在24h轉(zhuǎn)染過(guò)程中，生長(zhǎng)速度比較快，這樣的狀況會(huì)影響到轉(zhuǎn)染效果嗎？ 求大牛幫幫忙！ |
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倩女
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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3樓2014-02-25 16:48:54
yipan 
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2樓2014-02-25 16:44:59
yipan
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
倩女: 金幣+3, ★★★很有幫助, 多謝 2014-02-25 17:06:47
倩女: 金幣+3, ★★★很有幫助, 多謝 2014-02-25 17:06:47
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說(shuō)血清不影響轉(zhuǎn)染效率是不負(fù)責(zé)任的話(huà)。轉(zhuǎn)染是需要一定的細(xì)胞密度的對(duì)吧，所以我建議還是低濃度的FBS和轉(zhuǎn)染過(guò)程中更換幾次培養(yǎng)基。 大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。 通常的，血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生 長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。因此在轉(zhuǎn)染前建議先測(cè)試出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)良好的血清批號(hào)，轉(zhuǎn)染時(shí)用同一批號(hào)的血清，并同時(shí)做負(fù)對(duì)照（不加轉(zhuǎn)染試劑及外源DNA）以測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)是否正常。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下 效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死 亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。 |
4樓2014-02-25 17:00:11
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無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24h 這個(gè)太久了吧。 siRNA片段嗎？還是shRNA質(zhì)粒？ 其實(shí)和大眾的轉(zhuǎn)質(zhì)粒什么的都差不對(duì)，做法也類(lèi)似的。最好做病毒，但麻煩會(huì)有危險(xiǎn)。電轉(zhuǎn)要求太苛刻，細(xì)胞量啊、質(zhì)粒量啊，脂質(zhì)體簡(jiǎn)單好做。 最初脂質(zhì)體，做法中很看重?zé)o血清的那4-6個(gè)小時(shí)，然后換完全。 現(xiàn)在技術(shù)進(jìn)步了，有點(diǎn)血清也問(wèn)題不大，當(dāng)然無(wú)血清的還是會(huì)好點(diǎn)。用opti-mem會(huì)更好。 主要是看你的要求，穩(wěn)轉(zhuǎn)的話(huà)這個(gè)方法不好，還是病毒靠譜，要不篩的麻煩。 瞬轉(zhuǎn)的話(huà)還好 我覺(jué)得這些都無(wú)所謂，自從用了流式后， 只要有標(biāo)記物，轉(zhuǎn)了的分出來(lái)不就行了，效率低多做點(diǎn)，多轉(zhuǎn)點(diǎn)。是會(huì)浪費(fèi)錢(qián)，但會(huì)很省時(shí)間，沒(méi)必要糾結(jié)這個(gè)問(wèn)題，大踏步的向前進(jìn)吧，時(shí)間不等人啊。。。。。。。。。 |
5樓2014-02-25 21:55:05
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