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yyailxw0520新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
綿羊全血提取DNA詳細(xì)步驟 已有1人參與
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包括試劑配制 注：哺乳動(dòng)物DNA在白細(xì)胞內(nèi) 紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核 已經(jīng)嘗試過(guò)四種方法 但是濃度始終處于20ng/ul左右 后期還要純化PCR產(chǎn)物再酶切 這個(gè)濃度用loading buffer跑DNA條帶幾乎不顯 很淡在下動(dòng)物遺傳小碩 求大神指點(diǎn)！��！在此拜過(guò)�。。。。。。。。。。。。。。�！越詳細(xì)越好！�。。。�！ |
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youlinglyw
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yyailxw0520(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2014-03-07 09:42:34
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yyailxw0520(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵(lì)交流 2014-03-07 09:42:34
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綿羊？人類(lèi)的可不可以，大把大把的技術(shù)都有 1.新鮮抗凝血，離心棄去上清液； 2.取出4℃冰箱預(yù)冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向細(xì)胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml細(xì)胞壓積加入6-10ml裂解液），輕輕吹打混勻； 紅細(xì)胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加雙蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加雙蒸水50ml,再加上上面的450ml,共計(jì)500ml,高壓滅菌, 用時(shí)加10-20ml 3.800-1000rpm離心5-8分鐘，離心棄去上層紅色清液； 4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或無(wú)血清培養(yǎng)液離心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重復(fù)步驟2和3； 6.重懸細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；提取DNA，最好是于步驟4開(kāi)始使用DEPC水配制的溶液進(jìn)行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。 原則：（1）防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；（2）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。 一、試劑準(zhǔn)備 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。 3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．無(wú)水乙醇、75%乙醇 二、操作步驟 （一）材料處理 1．白細(xì)胞處理 ⑴ 取紅細(xì)胞裂解完全后收集的沉淀，加入0.5ml TE ⑵ 將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。 ⑶ 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl，混勻。 ⑷ 60°C水浴1-3hr。 2．培養(yǎng)細(xì)胞處理： ⑴ 將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。 ⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。 ⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液。 ⑷ 50-55°C水浴1-2hr。 （二）DNA提取 1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。 2. 離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。 3. 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。 4. 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。 5. 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。 6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。 7. 待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。 8. 沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。 9. 室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100ml TE溶解過(guò)夜。 (三）DNA定量和電泳檢測(cè) 1.DNA定量： DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。 DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說(shuō)明含有RNA，比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。 2.電泳檢測(cè)： 取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)DNA的完整性，或多個(gè)樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。 三、注意事項(xiàng) 1. 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。 2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。 3. 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。 4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)（如Southern 雜交、PCR等）目的。如要求更高，可參考有關(guān)資料進(jìn)行DNA純化。 |
2樓2014-03-06 22:33:23
潘meiqiao
新蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2015-10-24 21:22:51
4樓2019-01-07 13:13:47
5樓2019-03-21 17:06:26
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