yyailxw0520

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[求助] 綿羊全血提取DNA詳細步驟已有1人參與

包括試劑配制注：哺乳動物DNA在白細胞內(nèi) 紅細胞無細胞核

已經(jīng)嘗試過四種方法但是濃度始終處于20ng/ul左右后期還要純化PCR產(chǎn)物再酶切這個濃度用loading buffer跑DNA條帶幾乎不顯很淡
在下動物遺傳小碩求大神指點！��！在此拜過�。。。。。。。。。。。。。。�！越詳細越好�。。。。�！

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1樓 2014-03-06 21:29:19

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潘meiqiao

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同求有木有哺乳動物的啊？？哺乳動物全血提取DNA？

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3樓2015-10-24 21:22:51

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youlinglyw

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yyailxw0520(kx444555代發(fā)): 金幣+5, 鼓勵交流 2014-03-07 09:42:34

綿羊？人類的可不可以，大把大把的技術(shù)都有

1.新鮮抗凝血，離心棄去上清液；
2.取出4℃冰箱預(yù)冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向細胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml細胞壓積加入6-10ml裂解液），輕輕吹打混勻；

紅細胞裂解液ELS配方：
NH4Cl:4.15克加雙蒸水500ml,取450ml;
Tris:1.0297克加雙蒸水50ml,再加上上面的450ml,共計500ml,高壓滅菌,
用時加10-20ml

3.800-1000rpm離心5-8分鐘，離心棄去上層紅色清液；
4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或無血清培養(yǎng)液離心洗2-3次；
5.如裂解不完全可重復(fù)步驟2和3；
6.重懸細胞，用于后續(xù)實驗；提取DNA，最好是于步驟4開始使用DEPC水配制的溶液進行.
酚氯仿方法提取DNA
在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實驗。
原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。
一、試劑準備
1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS
5．2mg/ml蛋白酶K
6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7．無水乙醇、75%乙醇
二、操作步驟
（一）材料處理
1．白細胞處理
⑴ 取紅細胞裂解完全后收集的沉淀，加入0.5ml TE
⑵ 將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。
⑶ 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl，混勻。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培養(yǎng)細胞處理：
⑴ 將培養(yǎng)細胞懸浮后，用TBS洗滌一次。
⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。
⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取
1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。
2. 離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。
3. 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
4. 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。
5. 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。
6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。
7. 待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g×5min，棄上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。
9. 室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100ml TE溶解過夜。
(三）DNA定量和電泳檢測
1.DNA定量：
DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度，OD值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2O為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。
DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。
2.電泳檢測：
取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測DNA的完整性，或多個樣品的濃度是否相同。電泳結(jié)束后在點樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。
三、注意事項
1. 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。
2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實驗（如Southern 雜交、PCR等）目的。如要求更高，可參考有關(guān)資料進行DNA純化。

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天行健

2樓2014-03-06 22:33:23

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吃瓜的半仙

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提取全血dna之前有用BIOG DNA Blood Isolate Kit，但是提取的是大鼠的，測出來的紫外值有1.85，后續(xù)呀做了qpcr，ct值在26左右，但是哺乳動物的實驗還沒有做過。

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4樓2019-01-07 13:13:47

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宇宙小妖怪

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我們實驗室用BIODAI離心法提取過大鼠全血中的DNA，如果DNA濃度不高就用3倍體積的無水乙醇、0.1體積的NaAC和1ul 15mg/ml的glycogen沉淀進行濃縮。

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5樓2019-03-21 17:06:26

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