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無(wú)敵小莫

銅蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] pet32a雙酶切之后，電泳條帶找不到已有3人參與

小弟本科生一枚，最近在構(gòu)建一種菌，可是經(jīng)過(guò)了兩個(gè)月的嘗試，還是沒(méi)有成功，愁死了，這個(gè)是學(xué)校的一個(gè)大學(xué)生訓(xùn)練項(xiàng)目，搞了這么久還沒(méi)構(gòu)建出菌種，我在九月之前還要做出目的蛋白的表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白的性質(zhì)做出研究，才能結(jié)題，現(xiàn)在是愁死了，求告各位大俠給予意見(jiàn)。
首先，我用的是X-hol和BamHI這兩個(gè)酶，目的基因在2700左右，目的基因在經(jīng)過(guò)PCR之后，做37度雙酶切6h能跑出目的條帶。這個(gè)是確定的。但是在雙酶切32a質(zhì)粒之后，確實(shí)無(wú)論如何也跑不出條帶。后來(lái)又做了單酶切切pet-32a質(zhì)粒，但是3h之后，依舊是沒(méi)有任何條帶出現(xiàn)。（聲明：32a未經(jīng)酶切的質(zhì)粒是跑得出來(lái)的。）今日又做了分小時(shí)單酶切，做法是每半小時(shí)去一次37度酶切樣品，迅速放入65度烘箱中使其中的酶失活，共切了兩個(gè)小時(shí)，卻還是沒(méi)有跑出任何條帶，這不應(yīng)該啊，剛加入酶就取樣的也沒(méi)跑出來(lái)，這太不合理了吧！（取樣：2微升跑膠。）今天的除了沒(méi)有酶切過(guò)的質(zhì)粒跑出來(lái)了非常明顯的條帶，其余的都沒(méi)跑出來(lái)，是跑膠打樣太少了么？
雙酶切體系：50微升
10Xbuffer tango 10微升
BamHi                2微升
X-hol                   2微升
pet-32a質(zhì)粒                   36微升（有時(shí)質(zhì)粒濃度高的話也會(huì)用25微升質(zhì)粒加11微升ddH2O）
37度水浴6h
單酶切體系：20微升
buffer tango    4微升
BamHI             0.5微升
32a質(zhì)粒       10微升
ddH2O          5.5微升

單酶切體系：20微升
buffer tango 4微升
X-hol             0.5微升
32a質(zhì)粒       10微升
ddH2O          5.5微升

另外，跑膠電壓是100V 時(shí)間是40分鐘這個(gè)應(yīng)該不會(huì)有什么問(wèn)題吧？

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1樓 2014-03-06 22:13:19

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well_想太多

新蟲(chóng) (小有名氣)

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我現(xiàn)在也遇到同樣的問(wèn)題了，想問(wèn)下怎么判斷是質(zhì)粒的問(wèn)題呢？

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11樓2014-10-03 19:30:58

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youlinglyw

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【答案】應(yīng)助回帖

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無(wú)敵小莫(kx444555代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2014-03-07 09:41:30

個(gè)人覺(jué)得你的酶可能出問(wèn)題了

你可以做以下嘗試

將酶切的質(zhì)粒和不酶切的質(zhì)粒同條件處理（6小時(shí)，溫度）

然后去檢測(cè)

2 按時(shí)間酶切，分別酶切15分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，電泳

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天行健

2樓2014-03-06 22:46:22

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無(wú)敵小莫

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引用回帖:

2樓: Originally posted by youlinglyw at 2014-03-06 22:46:22
個(gè)人覺(jué)得你的酶可能出問(wèn)題了

你可以做以下嘗試

將酶切的質(zhì)粒和不酶切的質(zhì)粒同條件處理（6小時(shí)，溫度）

然后去檢測(cè)

2 按時(shí)間酶切，分別酶切15分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，電泳

我之前也做過(guò)對(duì)照了，只是沒(méi)有同等條件處理，是將提出來(lái)的質(zhì)粒，和酶切后的同時(shí)跑膠，結(jié)果是酶切后的沒(méi)跑出來(lái)。還有，如果酶出了問(wèn)題，那目的基因又是怎么會(huì)切出來(lái)呢？你說(shuō)的第二個(gè) 我明天再做下。

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3樓2014-03-06 22:53:01

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lvbobo823

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【答案】應(yīng)助回帖

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2014-03-07 09:41:35

換個(gè)新酶試試吧，單酶切雙酶切都沒(méi)有出帶，再一個(gè)你的質(zhì)粒確定是32a并且有這幾個(gè)酶切位點(diǎn)。

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hehe

4樓2014-03-07 08:14:46

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普通表情龍兔虎貓

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