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neurovas金蟲 (小有名氣)
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求助帖，看看這段話什么意思？ 已有1人參與
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Hemoglobin from bovine blood was obtained from Sigma. Methemoglobin was prepared by oxidation of Hb with a 2-fold excess of potassium ferricyanide and passage through a Sephadex G-25 column using 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) as an eluent. Oxyhemoglobin was obtained by reduction of Hb with a 10-fold excess of sodium dithionite. The solution was then bubbled with O2 and purified on a Sephadex G-25 column. Concentrations of metHb and oxyHb were determined spectrophotometrically using ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, b, expressed per heme (Antonini & Brunori, 1971). FerrylHb was prepared by incubation 1.5 × 10–5 M MetHb with an equimolar amount of H2O2 in relation to the heme group in 10 mM phosphate buffer at room temperature for 5 min (Sztiller et al., 2006). 重點是 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 測完這兩個值之后，是相加得出oxyHb的濃度嗎？文章里面似乎并沒有講清楚。求助各位高手給解決一下！ 下面附有全文！謝謝！ |
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2014-03-08 20:16:28, 871.61 K
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有看過這篇paper么? http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0014579398813458 也提到類似的東西，或許可以給你一點提示…… |
2樓2014-03-21 07:45:45
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我談談我的理解 很明顯這兩個epsilon值相差很大 ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, 這里405nm是文中提到的max值，理論上測這個值就可以算出metHb的濃度 但是這里有一個問題，就是他metHb是怎么來的？ 他是從Hb氧化而來，而Hb在這個區(qū)段同樣有很強的光吸收，只要是反應，就不可能是100%的， 所以我覺得他后面選的那個500nm，應該是選的對MetHb而言光吸收很少，但是Hb還有相當光吸收的區(qū)段，等于這個是測光的本底，要把405nm處測的MetHb+Hb，減去500 nm處測的Hb本底。 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 這個應該是同理 我找到的Hb和OxyHb的吸收光譜圖 很明顯到了577nm，OxyHb的光吸收已經很少，而Hb還有相當的光吸收。 供你參考！ QQ截圖20140321151039.png |
5樓2014-03-21 15:11:57
neurovas
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就我查了一會，其實怎么定量不同類型的血紅蛋白，有很多方法，爭議也就在于取什么波長，考慮的無非兩點， 第一，待測物在這個波長的光吸收能力要強，這樣才能測的準 第二，這個波長，除了待測物之外，其他物質的光吸收要最弱，這樣才能干擾小 比如蛋白質和核酸，這個做生化的都知道，一個最大在280，一個在260，但是很明顯280處核酸也有相當的吸收，反之亦然。 所以測蛋白，尤其是核酸，要講究一個260/280的比值，用這個表示純度。也就是說，根據260光吸收算出來的值準不準，要取決于這個樣品純不純。 對于血紅蛋白而言，這一點更難實現，不管是什么狀態(tài)的血紅蛋白，導致強光吸收能力的還是heme，heme的大pai鍵，所以導致不管什么類型，他們的最大光吸收波長相差不大，而如果根據選擇待測物最大光吸收波長處測量誤差最小的原則，就同樣伴隨著背景最高。 所以我的理解是你引用的方法中，權宜之計只好再選一個，待測物光吸收能力較弱，而已經背景還有相當強光吸收的波段，測得背景。 所以實際操作很簡單 每一份樣品你都測415nm和577nm，得到兩個光吸收值，然后算出濃度 濃度相減，就得到你待測物的理論實際濃度 希望有所幫助 |
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neurovas7樓2014-03-22 11:23:35
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