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neurovas金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助帖，看看這段話什么意思？ 已有1人參與
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Hemoglobin from bovine blood was obtained from Sigma. Methemoglobin was prepared by oxidation of Hb with a 2-fold excess of potassium ferricyanide and passage through a Sephadex G-25 column using 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) as an eluent. Oxyhemoglobin was obtained by reduction of Hb with a 10-fold excess of sodium dithionite. The solution was then bubbled with O2 and purified on a Sephadex G-25 column. Concentrations of metHb and oxyHb were determined spectrophotometrically using ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, b, expressed per heme (Antonini & Brunori, 1971). FerrylHb was prepared by incubation 1.5 × 10–5 M MetHb with an equimolar amount of H2O2 in relation to the heme group in 10 mM phosphate buffer at room temperature for 5 min (Sztiller et al., 2006). 重點(diǎn)是 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 測(cè)完這兩個(gè)值之后，是相加得出oxyHb的濃度嗎？文章里面似乎并沒有講清楚。求助各位高手給解決一下！ 下面附有全文！謝謝！ |
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2014-03-08 20:16:28, 871.61 K
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有看過這篇paper么? http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0014579398813458 也提到類似的東西，或許可以給你一點(diǎn)提示…… |
2樓2014-03-21 07:45:45
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我談?wù)勎业睦斫?br />
很明顯這兩個(gè)epsilon值相差很大 ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, 這里405nm是文中提到的max值，理論上測(cè)這個(gè)值就可以算出metHb的濃度 但是這里有一個(gè)問題，就是他metHb是怎么來的？ 他是從Hb氧化而來，而Hb在這個(gè)區(qū)段同樣有很強(qiáng)的光吸收，只要是反應(yīng)，就不可能是100%的， 所以我覺得他后面選的那個(gè)500nm，應(yīng)該是選的對(duì)MetHb而言光吸收很少，但是Hb還有相當(dāng)光吸收的區(qū)段，等于這個(gè)是測(cè)光的本底，要把405nm處測(cè)的MetHb+Hb，減去500 nm處測(cè)的Hb本底。 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 這個(gè)應(yīng)該是同理 我找到的Hb和OxyHb的吸收光譜圖 很明顯到了577nm，OxyHb的光吸收已經(jīng)很少，而Hb還有相當(dāng)?shù)墓馕铡?br /> 供你參考！ QQ截圖20140321151039.png |
5樓2014-03-21 15:11:57
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就我查了一會(huì)，其實(shí)怎么定量不同類型的血紅蛋白，有很多方法，爭議也就在于取什么波長，考慮的無非兩點(diǎn)， 第一，待測(cè)物在這個(gè)波長的光吸收能力要強(qiáng)，這樣才能測(cè)的準(zhǔn) 第二，這個(gè)波長，除了待測(cè)物之外，其他物質(zhì)的光吸收要最弱，這樣才能干擾小 比如蛋白質(zhì)和核酸，這個(gè)做生化的都知道，一個(gè)最大在280，一個(gè)在260，但是很明顯280處核酸也有相當(dāng)?shù)奈�，反之亦然�?br /> 所以測(cè)蛋白，尤其是核酸，要講究一個(gè)260/280的比值，用這個(gè)表示純度。也就是說，根據(jù)260光吸收算出來的值準(zhǔn)不準(zhǔn)，要取決于這個(gè)樣品純不純。 對(duì)于血紅蛋白而言，這一點(diǎn)更難實(shí)現(xiàn)，不管是什么狀態(tài)的血紅蛋白，導(dǎo)致強(qiáng)光吸收能力的還是heme，heme的大pai鍵，所以導(dǎo)致不管什么類型，他們的最大光吸收波長相差不大，而如果根據(jù)選擇待測(cè)物最大光吸收波長處測(cè)量誤差最小的原則，就同樣伴隨著背景最高。 所以我的理解是你引用的方法中，權(quán)宜之計(jì)只好再選一個(gè)，待測(cè)物光吸收能力較弱，而已經(jīng)背景還有相當(dāng)強(qiáng)光吸收的波段，測(cè)得背景。 所以實(shí)際操作很簡單 每一份樣品你都測(cè)415nm和577nm，得到兩個(gè)光吸收值，然后算出濃度 濃度相減，就得到你待測(cè)物的理論實(shí)際濃度 希望有所幫助 |
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neurovas7樓2014-03-22 11:23:35
neurovas
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8樓2014-03-23 00:17:29
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