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licunyu鐵蟲 (初入文壇)
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雙酶切 已有3人參與
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最近在做雙酶切（TAKARA家的Xba1/Xho1 共用Buffer為10XM）,想重新構(gòu)建真核表達(dá)載體（目的片段210bp+載體） 1、雙酶切（20μl體系，1-3小時(shí)都試過），只能切開Xho1位點(diǎn)（與分步酶切對(duì)照過） 2、分步雙酶切，第一步酶切，不管先切哪個(gè)位點(diǎn)，跑膠檢測都能切開，但是到第二步酶切結(jié)束，想切膠回收的時(shí)候，卻怎么也跑不出條帶來了，只是模糊的一片，像拖帶一樣，我的DNA去哪兒了？愁死了，求高手指點(diǎn)迷津，感激不盡啊，跪謝�。。� 注：關(guān)于分步酶切膠回收損失的問題，我特意在第一步酶切結(jié)束后，嘗試過三種方法 a、切膠回收（測得濃度為60ng左右） b、不跑膠，直接在原體系里進(jìn)行第二步酶切 c、不跑膠，直接過柱回收（切膠回收試劑盒，不是專業(yè)的DNA分離柱） |
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lihe131
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2樓2014-03-09 16:08:26
licunyu
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6樓2014-03-10 08:32:13
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 試一下雙酶切同時(shí)進(jìn)行，兩種限制性內(nèi)切酶應(yīng)該有各自適宜的溫度，在PCR儀里酶切，第一步設(shè)第一種酶的適宜溫度和時(shí)間，第二步設(shè)第二種酶的適宜溫度和時(shí)間，第三步設(shè)一個(gè)能讓兩種酶都終止反應(yīng)的溫度和時(shí)間。電泳檢測時(shí)時(shí)間稍長一些。有條件的話可以試一下。 |
8樓2014-03-11 12:56:15
licunyu
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