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pser2011銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
一個(gè)基因做TA克隆后送去測(cè)序，不同的單克隆后來(lái)結(jié)果不一致，1500bp里有的11個(gè)堿基不同 已有5人參與
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金唯智公司測(cè)的�；蛐蛄形粗�，這可用那個(gè)構(gòu)建表達(dá)載體呀，大神有知道解決辦法的，救命��！ 看了氨基酸的序列，多數(shù)單克隆間氨基酸序列一致，這樣的話(huà)隨便挑一個(gè)單克隆做還是有什么挑選的規(guī)則？ [ Last edited by pser2011 on 2014-3-10 at 21:26 ] |
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pser2011(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-16 14:42:52
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pser2011(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-16 14:42:52
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1.對(duì)于這種情況，首先看一下測(cè)序的峰圖，確定是否是單峰，是不是背景雜峰比較多，測(cè)序公司會(huì)把背景雜峰較高的反應(yīng)也算作成功反應(yīng)的。 2.將測(cè)序結(jié)果翻譯成蛋白質(zhì)序列，到NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中去blast，然后看是否有完全一致的比對(duì)結(jié)果，選擇有完全一致比對(duì)結(jié)果的序列進(jìn)行后續(xù)克隆 一般來(lái)說(shuō)，Taq聚合酶的突變率不會(huì)有這么高，1500bp有1到2個(gè)克隆算是正常。出現(xiàn)多個(gè)測(cè)序結(jié)果的情況，可能是由于測(cè)序結(jié)果不好（雜峰導(dǎo)致序列差異），或者是模板不純（混有多個(gè)基因組等），PCR的退火溫度太低(45-50度)。 如果可能的話(huà)，可以使用Pfu等高保真的酶再做一下 |
4樓2014-03-11 11:00:49
lvbobo823
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2樓2014-03-10 22:23:45
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pser2011(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-16 14:42:31
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有幾個(gè)細(xì)節(jié)可能引起上述問(wèn)題： 1. PCR，盡量用保真性好的酶（其實(shí)普通Taq酶，一般1.5kb也就可能引起1-2個(gè)堿基突變），適當(dāng)提高退火溫度； 2. 如果切膠回收片段，盡量減短紫外照射時(shí)間，很可能引起較多突變； 3. 測(cè)序結(jié)果，最好自己根據(jù)峰圖拼接選擇。 |
3樓2014-03-11 10:51:46
pser2011
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takara的primerSTAR GXL 據(jù)說(shuō)是高保真的，那些差異的堿基峰圖我也看了，很清晰沒(méi)有背景干擾。是模板的問(wèn)題？我的模板是cDNA，幾次單克隆重復(fù)間測(cè)序的結(jié)果并不是明顯的分成兩種，如果根據(jù)這個(gè)測(cè)序結(jié)果的話(huà)，我這模板簡(jiǎn)直就是個(gè)混合物呀，  翻譯成氨基酸序列的話(huà)有兩個(gè)氨基酸的差異，很多堿基變化并沒(méi)有引起氨基酸變，這有沒(méi)有可能是大腸桿菌里質(zhì)粒復(fù)制的時(shí)候產(chǎn)生這么多變異？ |
5樓2014-03-14 14:00:03
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