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糖包子007銅蟲 (初入文壇)
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求助：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
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【答案】應(yīng)助回帖
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糖包子007: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1, 謝謝 我需要的是高效液相色譜所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2014-04-04 12:17:48
糖包子007: 金幣+10, 博學(xué)EPI+1, 謝謝 我需要的是高效液相色譜所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2014-04-04 12:17:48
以下是本人查到的相關(guān)資料，希望可以幫到你 （另附標(biāo)準(zhǔn)曲線制作圖表）標(biāo)準(zhǔn)曲線是溶液中氨基酸濃度與溶液吸光度關(guān)系的函數(shù)曲線。 一般濃度越大，吸收度越高，肯定是正比例曲線，關(guān)鍵還是要看看你是如何測定的？測定數(shù)據(jù)是什么，測定出的數(shù)據(jù)的線性如何？ 線性非常重要啊，一定要計(jì)算一下注明啊，否則一切白搭。 OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度，是檢測方法里出現(xiàn)的專有名詞 :光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。 那么10mm比色皿測得OD值就應(yīng)該是5mm比色皿測得OD值的2倍. 國標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法： 分別吸取0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml氨基酸工作液于一組25ml容量瓶中，各加水4ml,加水至4ml比較好 ，ph8.0磷酸緩沖液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml,在沸水加熱15min,，冷卻改為迅速冷卻 后加水定容至25ml,放置10min后,用5mm比色杯在570nm處測定吸光度.將測得的吸光度與相應(yīng)的谷基酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液:稱取100mg的谷氨酸(純度不低于99%)溶于100ml水中,作為母液.準(zhǔn)確吸取5ml母液,加水定容至50ml作為工作液(1ml含谷氨酸0.1mg) 試液配制部分請?jiān)俸瞬? pH8.0磷酸鹽緩沖液: 按GB 8313—87《茶 茶多酚測定》中3.2的規(guī)定,配制1/15M磷酸氫二鈉(3.2.1)和 1/15M磷酸二氫鉀(3.2.2)溶液。然后取1/15M的磷酸氫二鈉溶液95mL和1/15M磷酸二氫 鉀溶液5mL,混勻。 3.2 2％茚三酮溶液: 稱取水合茚三酮(純度不低于99％)2g,加50mL水和80mg氯化亞錫 (GB638—78,分析純),攪拌均勻。分次加少量水溶解,放在暗處,靜置一晝夜,過濾后加水 定容至100mL。茚三酮若變?yōu)槲⒓t色，則需按下法重結(jié)晶：稱取5g 茚三酮溶于15～25mL 熱蒸餾水中，加入0.25g 活性炭，輕輕攪拌。加熱30min 后趁熱過濾，濾液放入冰箱過夜。次日析出黃白色結(jié)晶，抽濾，用1mL 冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器干燥后，裝入棕色玻璃瓶保存。 注: 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),所用蒸餾水,必須是二次蒸餾水。 實(shí)驗(yàn)遇到失敗應(yīng)該是操作或試劑引起的，我認(rèn)為最有可能出錯(cuò)的地方有兩個(gè)： 1. 移取液體時(shí)是否是用移液管移的或者是用移液槍移的，特別要提醒的是移液槍會(huì)因吸頭的影響而導(dǎo)致加樣量不準(zhǔn)。 2. 沸水加熱時(shí)是否會(huì)蒸干，因?yàn)槔锩嫒芤毫坎⒉欢啵?5分鐘可能會(huì)蒸發(fā)大量水分，使部分茚三酮和氨基酸析出并附在容量瓶壁上而未參加反應(yīng)。我認(rèn)為加熱時(shí)應(yīng)該把蓋子蓋上，雖然會(huì)被蒸汽沖開，但應(yīng)馬上蓋回去，并在加熱過程中最好偶爾搖動(dòng)。 |
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2014-04-01 18:36:32, 14.5 K
2樓2014-04-01 18:38:26
lixiaoya8892
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3樓2014-04-02 10:26:46
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【答案】應(yīng)助回帖
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糖包子007: 金幣+9, 謝謝 我需要的是高效液相色譜所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2014-04-04 12:18:44
糖包子007: 金幣+9, 謝謝 我需要的是高效液相色譜所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2014-04-04 12:18:44
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1．原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物(除脯氨酸外均有此反應(yīng))，該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波波長為570 nm，據(jù)此可以用吸光光度法測定樣品中氨基酸含量。 2．儀器 可見分光光度計(jì)。 3.試劑 ①2％茚三酮溶液：稱取茚三酮1 g于盛有35 mL熱水的燒杯中使其溶解，加入40 mg氯化亞錫(SnCl2·H2O)，攪拌過濾(作防腐劑)。濾液置冷暗處過夜，加水至50 mL，搖勻備用。 ②pH 8．04磷酸緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀(KH2P04)4．5350 g于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻備用。 注意點(diǎn)：http://1000eb.com/va94 準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4)11．9380 g于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻備用。 取上述配好的磷酸二氫鉀溶液lO．0mL與190mL磷酸氫二鈉溶液混合均勻，即為pH8．04的磷酸緩沖溶液。 ③氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥的氨基酸(如異亮氨酸)O．200 0 g于燒杯中，先用少量水溶解后，定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度線，搖勻。準(zhǔn)確吸取此液10．O mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。此為200µg·mL-1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。 4．操作步驟 ①樣品處理：準(zhǔn)確稱取粉碎樣品5～lO g或吸取液體樣品5～10 mL，置于燒杯中，加入50 mL蒸餾水和5 g左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40 mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻備測。 ②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確吸取200mol·L-1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液O．O、O．5、1．O、1．5、2．0、2．5、3．0 mL(相當(dāng)于O、100、200、300、400、500、600µg氨基酸)，分別置于25 mL容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為4．O mL然后加入茚三酮和磷酸緩沖溶液各1 mL，混合均勻，于水浴上加熱15 min，取出迅速冷至室溫，加水至刻度，搖勻。靜置15 min后，在570nm波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量(微克數(shù))為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ③樣品的測定：吸取澄清的樣品溶液1～4 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光度A值，用測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得對應(yīng)氨基酸含量。 5．計(jì)算 X= c÷(m×1000) ×100 式中：x——樣品氨基酸的含量，µg·(100 g)-1； c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸的含量，µg； m——測定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g。 6．說明 茚三酮在放置過程中易被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進(jìn)行純化，方法為：取10 g茚三酮溶于40 mL熱水中，加入l g活性炭，搖動(dòng)1 min，靜置30 min，過濾。將濾液放人冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過濾，用2 mL，冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器中干燥，裝瓶備用。 |
4樓2014-04-03 16:41:50
mao816816
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5樓2014-04-04 12:34:46
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糖包子007: 金幣+1 2014-04-07 07:51:09
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1 實(shí)驗(yàn) 1.1 儀器 Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動(dòng)進(jìn)樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計(jì)。 1.2 試劑 正纈氨酸（Norvaline，內(nèi)標(biāo)），OPA ，F(xiàn)MOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供； 醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上�；瘜W(xué)試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，F(xiàn)isher公司試劑； 氨基酸標(biāo)樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上�；瘜W(xué)試劑公司； 苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。 1.3 樣品處理 將煙葉在烘箱中恒溫40℃烘干至恒重，粉碎，過80目篩，篩下物為實(shí)驗(yàn)用煙樣粉末，置于廣口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取煙樣粉末1.000g于干燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時(shí)，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合并后的濾液用陽離子交換柱洗脫，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恒溫濃縮至干，最后用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內(nèi)標(biāo)10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進(jìn)行氨基酸分析。 樣品自動(dòng)柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。程序?yàn)椋何?μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進(jìn)樣。 1.4 色譜條件 色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm 流動(dòng)相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調(diào)pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。 流動(dòng)相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調(diào)pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均勻。 流速：0.45ml/min 柱溫：40℃ 紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm 淋洗梯度：見表1 表1 流動(dòng)相的淋洗梯度表 Table 1 The gradient time table of mobile phase 序列 時(shí)間（min） 流動(dòng)相A（%） 流動(dòng)相B（%） 流速（ml/min） 1 0.00 100.0 0.0 0.450 2 15.50 40.0 60.0 0.450 3 18.00 0.0 100.0 0.450 4 21.00 0.0 100.0 0.800 5 23.90 0.0 100.0 0.800 6 24.00 0.0 100.0 0.450 7 25.00 100.0 0.0 0.450 1.5 氮基酸的定性 用標(biāo)樣色譜圖、文獻(xiàn)參照和標(biāo)樣加入的方法，通過對照保留時(shí)間進(jìn)行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認(rèn)。 1.6 內(nèi)標(biāo)法定量 準(zhǔn)確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標(biāo)樣100μl于帶內(nèi)襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內(nèi)標(biāo)溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動(dòng)計(jì)算各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2 結(jié)果與討論 2.1 萃取溶劑的比較 氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統(tǒng)的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時(shí)RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個(gè)，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時(shí)RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個(gè)。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。 2.2 乙醇濃度的選擇 選擇五種不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結(jié)果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時(shí)，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進(jìn)行煙樣中游離氨基酸的提取。 2.3 不同純化方法的確定 在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質(zhì)、乙醚加入提取液萃取分離雜質(zhì)、5%磺基水楊酸加入提取液沉淀去除雜質(zhì)和陽離子交換樹脂吸附雜質(zhì)四種方法進(jìn)行了純化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性炭作為純化劑時(shí)其色譜圖中雜質(zhì)峰較少，但同時(shí)氨基酸峰亦有多個(gè)消失，主要是因?yàn)榛钚蕴繉Π被嵋灿休^強(qiáng)的吸附，它在吸附雜質(zhì)的同時(shí)也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時(shí)，雜質(zhì)去除不完全，其色譜圖均表現(xiàn)為雜質(zhì)峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴(yán)重，給定性定量工作帶來困難。當(dāng)用陽離子交換樹脂進(jìn)行純化時(shí)，其色譜圖中雜質(zhì)峰較少，基線平穩(wěn)，氨基酸峰分離較好，均可以進(jìn)行定性和定量分析，故本實(shí)驗(yàn)選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。 2.4 色譜分離 2.5 線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標(biāo)樣加入等體積的250 pmol/μ1的內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，氨基酸與內(nèi)標(biāo)的面積比為縱坐標(biāo)，得到各個(gè)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性，各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。 表2 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Table 2 Standard curves of 17 amino acids 氨基酸 線性方程 相關(guān)系數(shù) Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972 Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961 Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988 His Y=0.003719x+0.020168 0.9945 Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966 Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978 Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912 Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920 Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993 Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985 Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927 Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905 Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962 Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953 Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964 Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969 Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922 2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取云南C2F99煙樣做平行實(shí)驗(yàn)（n=5），進(jìn)行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關(guān)。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。 2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 用標(biāo)樣加入法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關(guān)；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結(jié)果令人滿意。 表3 分析方法的回收率 Table 3 Recovery percents of the analytical method 氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率% Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5 Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5 Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0 Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0 Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0 His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5 Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5 Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0 Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5 Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5 Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5 Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0 Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5 Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5 Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5 Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5 |
6樓2014-04-04 12:42:16
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