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天湖酒新蟲 (初入文壇)
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刪除幾個(gè)核苷酸用質(zhì)粒擴(kuò)增誘變可以嗎？ 已有3人參與
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我看到質(zhì)粒擴(kuò)增誘變基本是做把一個(gè)點(diǎn)變成另一個(gè)，我想要?jiǎng)h掉幾個(gè)核苷酸，也就編碼4~5個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，是不是引物設(shè)計(jì)的時(shí)候去掉就可以了，還是以刪除的位點(diǎn)為中心設(shè)計(jì)引物嗎？ 除了這個(gè)方法，還有什么簡(jiǎn)單的方法可以做到定點(diǎn)除去一個(gè)片段？ |
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lihe131
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2樓2014-04-01 16:51:56
天湖酒
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3樓2014-04-01 20:29:46
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4樓2014-04-01 23:31:19
lvbobo823
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5樓2014-04-02 08:47:20
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
天湖酒(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-04-02 09:46:23
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天湖酒(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-04-02 09:46:23
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看你的回復(fù)，應(yīng)該是在用基于甲基化降解(DpnI)的突變?cè)噭┖?br />
這種試劑盒設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要完全互補(bǔ)，擴(kuò)展之后加入DpnI，降解模板 你注意看一下說明書吧，刪除堿基的引物設(shè)計(jì)應(yīng)該也是把刪除的片段置于引物中間 不過一次4-5個(gè)堿基會(huì)造成突變效率下降的 還有一類突變?cè)噭┖惺荘CR后再連接的，引物設(shè)計(jì)是鄰接的，連接之后是一個(gè)完整的質(zhì)粒。 這樣的試劑盒，做刪除突變就比較容易，而且也沒有堿基長(zhǎng)度的限制，不過要求引物合成的時(shí)候5‘磷酸化 同時(shí)需要有一個(gè)能擴(kuò)增長(zhǎng)片段的高保真酶 如果沒有試劑盒，也沒有能擴(kuò)增長(zhǎng)片段的高保真酶，那么你可以在要?jiǎng)h除位點(diǎn)附近，尋找單酶切位點(diǎn)，然后像做重組克隆一樣，把質(zhì)粒雙酶切，然后再連入刪除了堿基的序列（這個(gè)可能要用到OverlapPCR） |
6樓2014-04-02 09:37:43
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