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星河鷺起金蟲 (初入文壇)
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[求助]
提蛋白遇到瓶頸了，實驗沒法繼續(xù)，各位大俠幫幫忙，一起找一下原因，有考染和銀染圖 已有1人參與
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最近提蛋白，考染后目的條帶范圍內(nèi)（20KD-50KD）一直沒有條帶，懷疑有降解，但PMSF才買不久，用的時候也很注意，但就是結(jié)果不得。我提蛋白的基本步驟是： 1、吸去培養(yǎng)液，然后靜置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底后再用移液器將其吸走。 2、每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液，將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。 3、按1ml裂解液（RIPA強，碧云天）加10 μl PMSF（100mM）的比例，配好裂解液搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。） 4、每瓶細(xì)胞加400μl 含PMSF的裂解液，先于冰上裂解10min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。 5、用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后冰上繼續(xù)裂解20min,然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行） 6、超聲三次，每次持續(xù)10S。（注意控制功率在20%--30%之間） 7、于4℃下12000rpm離心10min。（提前開離心機預(yù)冷）。 8、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中放于－80℃保存 求助各位大俠幫忙分析分析，找找原因。 |
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星河鷺起
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4樓2014-05-08 23:47:42
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