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丫頭小盆子新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助��！使用G418篩選突變體及檢測(cè)
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先向各位大牛前輩致敬！ 以下步入正題————請(qǐng)問(wèn)有做突變體的前輩沒(méi)有？我在這里急切的尋求幫助��！我快被這個(gè)實(shí)驗(yàn)搞瘋了，再這樣下去我都快抑郁——~~o(>_<  o ~~下面闡述下我最近遇到的問(wèn)題吧： 首先：我這里實(shí)驗(yàn)主要目的是想獲得突變體。轉(zhuǎn)化植物篩選的時(shí)候，用到的載體只有G418抗性。我的篩選過(guò)程是通過(guò)進(jìn)行組培實(shí)驗(yàn)完成的，篩選原理是基因重組，對(duì)抗性植株進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，引物設(shè)計(jì)片段嘗試過(guò)用（1）敲除載體上包括的目的基因片段以及（2）敲除載體上不包含的目的基因片段，但PCR結(jié)果都是能檢測(cè)出目的大小的條帶。 其次篩選過(guò)程為：G418篩選濃度到50ug/ml，篩選次數(shù)為3-4次，每次3-4天，篩選具體點(diǎn)就是轉(zhuǎn)化后的植物先在普通培養(yǎng)基上長(zhǎng)到芝麻到油菜籽大小時(shí)，用抗性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)3-4天，（這里解釋下為什么沒(méi)有直接轉(zhuǎn)化后就在抗性培養(yǎng)基上篩選，是因?yàn)槲矣X(jué)得剛轉(zhuǎn)化好的植物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，需要長(zhǎng)到一定程度才能篩選，不然會(huì)全部篩選死掉。還有就是每次篩選3-4天，篩選時(shí)間不是，也是因?yàn)槲矣X(jué)得植株太弱了，即使轉(zhuǎn)化進(jìn)去了，也容易被篩死掉.)。 問(wèn)題1：經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的篩選后，剩下1/10左右的材料培養(yǎng)長(zhǎng)大。然后提RNA，進(jìn)行半定量PCR，結(jié)果內(nèi)參能PCR出，野生型和突變體都能檢測(cè)到目的條帶。請(qǐng)問(wèn)下這個(gè)情況是屬于假陽(yáng)性么？但是我個(gè)人認(rèn)為假陽(yáng)性情況的話，植株不是應(yīng)該死掉或表現(xiàn)出葉片變黃或者表現(xiàn)出生理活性下降的表型嗎？還有，這種抗性植株不應(yīng)該是被我篩選馴化出來(lái)的吧？那這種情況是怎么回事呢？ 問(wèn)題2：因?yàn)檗D(zhuǎn)化植物時(shí)用到的載體標(biāo)志基因是nptII，我在NCBI上查到了該標(biāo)志基因的序列，然后用primer 5設(shè)計(jì)出序列進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果野生型和抗性植株均出現(xiàn)了nptII 目的大小的條帶。 我也Blast了nptII與該植物的序列，發(fā)現(xiàn)兩者序列很少重合，應(yīng)該是不可能出現(xiàn)pcr出植物本身序列這種情況的。 對(duì)于以上情況我已經(jīng)沒(méi)轍了，我也查了有關(guān)文獻(xiàn)，但是說(shuō)的都很簡(jiǎn)單，具體如何設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物等都不太明白。所以想求助各位有相關(guān)經(jīng)歷的前輩能提供點(diǎn)意見(jiàn)和問(wèn)題，指點(diǎn)一下我這個(gè)迷惘的小蟲子。謝謝！��！ 還有就是前輩們?cè)谶@個(gè)篩選試驗(yàn)中有遇見(jiàn)過(guò)類似這種情況么，遇到過(guò)的話又是如何解決的呢，還有就是想問(wèn)問(wèn)憑您的經(jīng)驗(yàn)覺(jué)得G418的抗性篩選有效期一般是多少天內(nèi)有效? 謝謝各位前輩的幫助！再次非常非常萬(wàn)分萬(wàn)分感謝！�。� 小蟲致敬！ |
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丫頭小盆子
新蟲 (小有名氣)
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2樓2014-04-27 09:46:33
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