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楊巖yer金蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于用Ellman法測(cè)巰基，在計(jì)算中出現(xiàn)負(fù)值是怎么回事 已有1人參與
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參考的方法如下： 取1mL在2.3.3.6中配制的豆?jié){溶液加入2.0mL的緩沖液1（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，pH=8.0）或緩沖液2（每升溶液含10.4gTris，6.9g甘氨酸，1.2g EDTA，480g尿素，pH=8.0）后再加入0.02mL的Ellman試劑（0.2gDTNB溶于50ml緩沖溶液1中），25℃下保溫5min，采用可見分光光度計(jì)，在412nm處測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)以不加豆?jié){，而加Ellman試劑為空白。巰基含量的測(cè)定= 73.53*A412*D/C , 式中A412為有DTNB存在時(shí)豆?jié){的吸光值減去無(wú)DTNB存在時(shí)豆?jié){的吸光值，D為稀釋倍數(shù)，C為豆?jié){固形物含量 這是一篇文獻(xiàn)中測(cè)定巰基的方法，我也是按這個(gè)過程操作的，在計(jì)算過程中A412（有DTNB存在時(shí)豆?jié){的吸光值減去無(wú)DTNB存在時(shí)豆?jié){的吸光值）出現(xiàn)了負(fù)值，不知道有么有人知道可能是什么問題造成的呢，該怎樣處理這個(gè)問題，而且已經(jīng)重復(fù)做了試驗(yàn)，確定不是操作失誤，會(huì)出現(xiàn)三四個(gè)負(fù)值，請(qǐng)問方法有什么可能存在的問題嗎？求大神解答啊 |
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4樓2014-05-03 23:13:19
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測(cè)定總巰基含量時(shí)，15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。測(cè)定自由巰基含量時(shí)，15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中，而后加入50 μL Ellman 試劑 （DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL），在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 處測(cè)定吸光值，以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對(duì)照。 巰基含量的計(jì)算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度（mg/mL） 問題1：上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的（具體的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 問題2：我測(cè)的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品，二硫鍵含量在350μmol/g附近，此種測(cè)試方法是否具有可行性 問題3：由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白，又沒喲測(cè)量二硫鍵含量的更好的方法 |
7樓2015-10-07 21:26:24
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