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ruchang2013鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
單酶切失敗。質(zhì)粒驗證顯示正確，但是PCR驗證與酶切驗證出現(xiàn)很多問題，麻煩大家解決下 已有3人參與
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對照為原質(zhì)粒pTKIP-cat:4kb,上面有單酶切位點ApaI,要插入的核酸片段為2.5kb左右，插入到ApaI位點 1、進行常規(guī)質(zhì)粒提取后，17菌株比對照大，所以將17菌株進行PCR及酶切驗證。 2、PCR驗證 引物IP1與IP2是原質(zhì)粒本身有的，galP1與glK2是在核酸片段上。重組成功后PCR驗證引物從up到down引物順序為IP1、glK2（一段堿基片段的下游引物）、galP1（一段堿基片段的上游引物）、IP2 若重組成功IP1/glK2能PCR出1359bp條帶，失敗無條帶； galP1/IP2：成功能PCR出1741bp條帶，失敗無條帶； IP1/IP2：成功與核酸片段反接都能PCR出3kb，質(zhì)粒自連則只能PCR出300bp 3、酶切驗證 BglII在核酸片段上，原質(zhì)粒沒有此酶切位點：若成功與核算片段反接，有近7kb條帶；質(zhì)粒自連則4kb條帶 ApaI：重組成功后，應(yīng)該能將核算片段切下，所以又2.5kb與原質(zhì)粒4kb的條帶 4、分析及疑問 常規(guī)質(zhì)粒提取后，17比對照條帶明顯大，但在后續(xù)驗證過程中出現(xiàn)疑問：a、每對引物都能PCR出大條帶，是質(zhì)粒本身？但是質(zhì)粒已經(jīng)稀釋20倍（PCR體系20 μL，質(zhì)粒加1μL）b、引物IP1/glK2與galP1/IP2 PCR小條帶近乎沒有；c、引物IP1/IP2能PCR出小條帶，與失敗一致；c、ApaI酶切，沒有小條帶出現(xiàn)，顯示失敗，但是BglII酶切與成功一致。最大可能為反接。 5、測序結(jié)果失敗，不能測序完整，只測序了一小部分。利用進行核算片段PCR的引物只能測120bp 2014.0426 常規(guī)檢測.png 2014.0427 17菌PCR酶切.png |
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