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ruchang2013鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
單酶切失敗。質(zhì)粒驗(yàn)證顯示正確，但是PCR驗(yàn)證與酶切驗(yàn)證出現(xiàn)很多問題，麻煩大家解決下 已有3人參與
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對(duì)照為原質(zhì)粒pTKIP-cat:4kb,上面有單酶切位點(diǎn)ApaI,要插入的核酸片段為2.5kb左右，插入到ApaI位點(diǎn) 1、進(jìn)行常規(guī)質(zhì)粒提取后，17菌株比對(duì)照大，所以將17菌株進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證。 2、PCR驗(yàn)證 引物IP1與IP2是原質(zhì)粒本身有的，galP1與glK2是在核酸片段上。重組成功后PCR驗(yàn)證引物從up到down引物順序?yàn)镮P1、glK2（一段堿基片段的下游引物）、galP1（一段堿基片段的上游引物）、IP2 若重組成功IP1/glK2能PCR出1359bp條帶，失敗無(wú)條帶； galP1/IP2：成功能PCR出1741bp條帶，失敗無(wú)條帶； IP1/IP2：成功與核酸片段反接都能PCR出3kb，質(zhì)粒自連則只能PCR出300bp 3、酶切驗(yàn)證 BglII在核酸片段上，原質(zhì)粒沒有此酶切位點(diǎn)：若成功與核算片段反接，有近7kb條帶；質(zhì)粒自連則4kb條帶 ApaI：重組成功后，應(yīng)該能將核算片段切下，所以又2.5kb與原質(zhì)粒4kb的條帶 4、分析及疑問 常規(guī)質(zhì)粒提取后，17比對(duì)照條帶明顯大，但在后續(xù)驗(yàn)證過(guò)程中出現(xiàn)疑問：a、每對(duì)引物都能PCR出大條帶，是質(zhì)粒本身？但是質(zhì)粒已經(jīng)稀釋20倍（PCR體系20 μL，質(zhì)粒加1μL）b、引物IP1/glK2與galP1/IP2 PCR小條帶近乎沒有；c、引物IP1/IP2能PCR出小條帶，與失敗一致；c、ApaI酶切，沒有小條帶出現(xiàn)，顯示失敗，但是BglII酶切與成功一致。最大可能為反接。 5、測(cè)序結(jié)果失敗，不能測(cè)序完整，只測(cè)序了一小部分。利用進(jìn)行核算片段PCR的引物只能測(cè)120bp 2014.0426 常規(guī)檢測(cè).png 2014.0427 17菌PCR酶切.png |
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4樓2014-05-07 03:30:28
~春夢(mèng)秋云~
金蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ruchang2013: 金幣+10, ★有幫助 2014-05-12 14:29:56
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ruchang2013: 金幣+10, ★有幫助 2014-05-12 14:29:56
| 個(gè)人建議，可以先做菌落PCR，如果p的出來(lái)再提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，還有marker跑的好奇怪，建議可以點(diǎn)兩種不同的比較，以檢驗(yàn)準(zhǔn)確性，至于PCR驗(yàn)證結(jié)果那么奇怪，覺得可能是酶切，連接出了問題，有時(shí)候切得不對(duì)，連的不對(duì)也很常見，酶切體系，還有時(shí)間都要注意。 |
2樓2014-05-06 22:14:02
biostar2009
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3樓2014-05-07 01:31:46
5樓2014-05-07 03:33:01
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