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merfect新蟲 (初入文壇)
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內(nèi)參GAPDH跑PCR總是做不好，總是雙峰，是怎么回事��？ 已有3人參與
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本人菜鳥一枚。用熒光PCR。原來用的這個(gè)內(nèi)參做大鼠細(xì)胞，按照50度2min預(yù)變性，95度15min變性，95度10s，60度32s退火，40循環(huán)然后熔解，做的都很好。現(xiàn)在換成骨髓，就做的很差。為什么啊？求分析。圖在下面。 細(xì)胞的時(shí)候CT值23，擴(kuò)增熔解都很好。 第一次，退火62度32s，CT值31，擴(kuò)增很好，熔解不好。 第二次，用了三步法，條件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循環(huán)然后熔解，CT值28，擴(kuò)增好，熔解不好，雙峰。是引物二聚體嗎？還是非特異性擴(kuò)增呢？ 第三次，改回兩步法，改為原來的60度32s，CT值24，擴(kuò)增好，熔解不好。還是雙峰。 第四次，兩步法，條件沒變，我最開始以為是骨髓提RNA，逆轉(zhuǎn)錄過程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，結(jié)果還是這樣。CT值24，擴(kuò)增好，熔解還是雙峰。 請(qǐng)問一下，這是什么原因呢？為什么GAPDH會(huì)做成這樣呢？和引物有關(guān)系嗎？我需要重新設(shè)計(jì)引物嗎？原來用大鼠細(xì)胞的時(shí)候這個(gè)引物是可以的啊，現(xiàn)在換成骨髓就不能用了嗎？或者，還需要改變什么條件才能變成單峰呢？ 多謝多謝！  第一次擴(kuò)增，62度32s，CT值31.jpg 第一次熔解.jpg 第二次擴(kuò)增，三步法，CT值28.jpg 第二次熔解.jpg 第三次擴(kuò)增，60度32s，CT值24.jpg 第三次熔解.jpg 第四次擴(kuò)增，換了新的cDNA，CT值24.jpg 第四次熔解.jpg |
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2樓2014-05-14 08:49:00
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3樓2014-05-14 16:57:13
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merfect(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
merfect(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
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你用cDNA樣品，可能有基因組污染，引物最好在2個(gè)外顯子的連接處，或者RNA樣品除DNA。 為避免非特異性擴(kuò)增，引物長(zhǎng)度必須大于20 bp（對(duì)于GAPDH，這樣做也難免出非特異性擴(kuò)增）。 一個(gè)笨辦法就是引物F、引物R分別在大鼠基因組庫(kù)（如果需要的話）和轉(zhuǎn)錄本庫(kù)中查找同源序列，記錄能完全匹配的那些序列（所在染色體和堿基序號(hào)），最后綜合引物F和引物R匹配的序列，看是否能擴(kuò)增出片段，長(zhǎng)度多少？ 或者設(shè)計(jì)的引物直接檢驗(yàn)，直到設(shè)計(jì)出合格的引物為止。因?yàn)镚APDH的同源序列太多，難免擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的片段。 |
4樓2014-05-14 17:37:06
merfect
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我也在想會(huì)不會(huì)是有污染。很有可能是提取過程中出現(xiàn)的污染。試劑盒說是可以完全去除DNA和蛋白的，但是我覺得我處理樣本的時(shí)候可能存在問題，導(dǎo)致污染的。請(qǐng)問一下，你處理過骨髓，用骨髓提取過RNA嗎？ 5樓2014-05-14 21:33:05
6樓2014-05-14 21:42:24
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呵呵。內(nèi)參就是文獻(xiàn)的，沒自己設(shè)計(jì)。你的意思是怎么測(cè)試引物��？blast嗎？ 8樓2014-05-15 20:47:26
merfect
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