 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (5810)
- >導(dǎo)師招生 (1079)
- >考研 (1030)
- >文獻(xiàn)求助 (477)
- >基金申請(qǐng) (475)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (246)
- >考博 (237)
- >休閑灌水 (176)
- >碩博家園 (146)
- >論文投稿 (105)
- >招聘信息布告欄 (83)
- >博后之家 (78)
- >公派出國(guó) (37)
- >論文道賀祈福 (35)
- >綠色求助(高懸賞) (28)
- >SciFinder/Reaxys (27)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 6389 | 回復(fù): 10 | ||
merfect新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
內(nèi)參GAPDH跑PCR總是做不好，總是雙峰，是怎么回事��？ 已有3人參與
|
|
本人菜鳥(niǎo)一枚。用熒光PCR。原來(lái)用的這個(gè)內(nèi)參做大鼠細(xì)胞，按照50度2min預(yù)變性，95度15min變性，95度10s，60度32s退火，40循環(huán)然后熔解，做的都很好。現(xiàn)在換成骨髓，就做的很差。為什么啊？求分析。圖在下面。 細(xì)胞的時(shí)候CT值23，擴(kuò)增熔解都很好。 第一次，退火62度32s，CT值31，擴(kuò)增很好，熔解不好。 第二次，用了三步法，條件50度2min，95度15min，95度10s，55度30s，72度32s，40循環(huán)然后熔解，CT值28，擴(kuò)增好，熔解不好，雙峰。是引物二聚體嗎？還是非特異性擴(kuò)增呢？ 第三次，改回兩步法，改為原來(lái)的60度32s，CT值24，擴(kuò)增好，熔解不好。還是雙峰。 第四次，兩步法，條件沒(méi)變，我最開(kāi)始以為是骨髓提RNA，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有污染，所以又重新做了一遍，用新的cDNA，結(jié)果還是這樣。CT值24，擴(kuò)增好，熔解還是雙峰。 請(qǐng)問(wèn)一下，這是什么原因呢？為什么GAPDH會(huì)做成這樣呢？和引物有關(guān)系嗎？我需要重新設(shè)計(jì)引物嗎？原來(lái)用大鼠細(xì)胞的時(shí)候這個(gè)引物是可以的啊，現(xiàn)在換成骨髓就不能用了嗎？或者，還需要改變什么條件才能變成單峰呢？ 多謝多謝！  第一次擴(kuò)增，62度32s，CT值31.jpg 第一次熔解.jpg 第二次擴(kuò)增，三步法，CT值28.jpg 第二次熔解.jpg 第三次擴(kuò)增，60度32s，CT值24.jpg 第三次熔解.jpg 第四次擴(kuò)增，換了新的cDNA，CT值24.jpg 第四次熔解.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有210人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 跑熒光定量PCR，目的基因都是NA，內(nèi)參基因均跑出來(lái)了，請(qǐng)問(wèn)是怎么回事？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 提RNA反轉(zhuǎn)錄后，用GAPDH和TLR進(jìn)行PCR，可是GAPDH條帶很亮，TLR怎么都出不來(lái)
已經(jīng)有14人回復(fù)
jurkat.1640
至尊木蟲(chóng) (文壇精英)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 908 (博后)
- 金幣: 17153.2
- 散金: 1654
- 紅花: 121
- 沙發(fā): 41
- 帖子: 14521
- 在線: 2184小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 514340
- 注冊(cè): 2008-02-28
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 病毒學(xué)
2樓2014-05-14 08:49:00
merfect
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 4
- 帖子: 8
- 在線: 1.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2439696
- 注冊(cè): 2013-04-27
- 專(zhuān)業(yè): 原發(fā)性腎臟疾病
3樓2014-05-14 16:57:13
jurkat.1640
至尊木蟲(chóng) (文壇精英)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 908 (博后)
- 金幣: 17153.2
- 散金: 1654
- 紅花: 121
- 沙發(fā): 41
- 帖子: 14521
- 在線: 2184小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 514340
- 注冊(cè): 2008-02-28
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 病毒學(xué)
★ ★ ★
merfect(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
merfect(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-05-14 18:11:35
|
你用cDNA樣品，可能有基因組污染，引物最好在2個(gè)外顯子的連接處，或者RNA樣品除DNA。 為避免非特異性擴(kuò)增，引物長(zhǎng)度必須大于20 bp（對(duì)于GAPDH，這樣做也難免出非特異性擴(kuò)增）。 一個(gè)笨辦法就是引物F、引物R分別在大鼠基因組庫(kù)（如果需要的話）和轉(zhuǎn)錄本庫(kù)中查找同源序列，記錄能完全匹配的那些序列（所在染色體和堿基序號(hào)），最后綜合引物F和引物R匹配的序列，看是否能擴(kuò)增出片段，長(zhǎng)度多少？ 或者設(shè)計(jì)的引物直接檢驗(yàn)，直到設(shè)計(jì)出合格的引物為止。因?yàn)镚APDH的同源序列太多，難免擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的片段。 |
4樓2014-05-14 17:37:06
merfect
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 4
- 帖子: 8
- 在線: 1.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2439696
- 注冊(cè): 2013-04-27
- 專(zhuān)業(yè): 原發(fā)性腎臟疾病
我也在想會(huì)不會(huì)是有污染。很有可能是提取過(guò)程中出現(xiàn)的污染。試劑盒說(shuō)是可以完全去除DNA和蛋白的，但是我覺(jué)得我處理樣本的時(shí)候可能存在問(wèn)題，導(dǎo)致污染的。請(qǐng)問(wèn)一下，你處理過(guò)骨髓，用骨髓提取過(guò)RNA嗎？ 5樓2014-05-14 21:33:05
6樓2014-05-14 21:42:24
jurkat.1640
至尊木蟲(chóng) (文壇精英)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 908 (博后)
- 金幣: 17153.2
- 散金: 1654
- 紅花: 121
- 沙發(fā): 41
- 帖子: 14521
- 在線: 2184小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 514340
- 注冊(cè): 2008-02-28
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 病毒學(xué)
7樓2014-05-15 08:49:34
merfect
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 4
- 帖子: 8
- 在線: 1.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2439696
- 注冊(cè): 2013-04-27
- 專(zhuān)業(yè): 原發(fā)性腎臟疾病
呵呵。內(nèi)參就是文獻(xiàn)的，沒(méi)自己設(shè)計(jì)。你的意思是怎么測(cè)試引物��？blast嗎？ 8樓2014-05-15 20:47:26
merfect
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 4
- 帖子: 8
- 在線: 1.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2439696
- 注冊(cè): 2013-04-27
- 專(zhuān)業(yè): 原發(fā)性腎臟疾病
9樓2014-05-15 20:50:38
Neo2000
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 639 (博士)
- 金幣: 8720.2
- 紅花: 37
- 帖子: 1700
- 在線: 269.3小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 322365
- 注冊(cè): 2007-03-11
- 專(zhuān)業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
10樓2014-05-15 21:02:44
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 merfect 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +14 | 于海海海海 2026-03-19 | 14/700 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑，一志愿華南理工大學(xué)071005 +5 | ioodiiij 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +8 | 何潤(rùn)采123 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
[考研] 化學(xué)求調(diào)劑 +3 | 臨澤境llllll 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 287求調(diào)劑 +3 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 346求調(diào)劑[0856] +3 | WayneLim327 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0817調(diào)劑 +3 | 沒(méi)有答案_ 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085700資源與環(huán)境308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 總分331 +3 | ZY-05 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號(hào) 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
|
zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 東南大學(xué)364求調(diào)劑 +5 | JasonYuiui 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +5 | 素年祭語(yǔ) 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 326求調(diào)劑 +3 | mlpqaz03 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856專(zhuān)碩279求調(diào)劑 +5 | 加油加油！? 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 中科大材料與化工319求調(diào)劑 +3 | 孟鑫材料 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 本科南京大學(xué)一志愿川大藥學(xué)327 +3 | 麥田耕者 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 招收0805（材料）調(diào)劑 +3 | 18595523086 2026-03-13 | 3/150 |
|