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ptccc銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
測(cè)酶活的蛋白怎么保存 已有2人參與
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各位親，之前一直做基因克隆啊神馬的，從沒了解過測(cè)酶活什么的。我有一大批樣品要測(cè)酶活，一次提蛋白是不可能的。我能不能從組織里提好蛋白放回-80保存，全部提完拿出來測(cè)酶活？還是提好了馬上就要測(cè)酶活？放-80要怎么保存？畢竟我覺得保存組織和蛋白肯定不一樣的吧？有做過的跟我說一下好嗎？謝謝 順便問一下，蛋白濃度能不能用微量測(cè)定儀測(cè)定��？考馬斯亮藍(lán)法很麻煩啊。但是微量測(cè)定儀測(cè)的發(fā)文章準(zhǔn)不準(zhǔn)啊 |
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winterb
鐵桿木蟲 (小有名氣)
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2樓2014-05-21 04:28:19
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為什么一定要用考馬斯亮藍(lán)法？nandrop不可以嗎？ 3樓2014-05-29 15:24:22
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ptccc(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-05-29 20:36:00
ptccc: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-05-31 10:12:39
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轉(zhuǎn)載： 一般一瓶動(dòng)物細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化，消化完以后用D-Hinks吹打下來，4℃，1000轉(zhuǎn)，6~10min 離心。倒掉上清，再用D-Hinks重新分散，4℃，1000轉(zhuǎn)，6~10min 離心，倒掉上清（如果暫時(shí)不要測(cè)酶活的話，直接將離心后的沉淀凍于-80℃，可保存2~3個(gè)月，用時(shí)直接加生理鹽水進(jìn)行后處理即可）。再用生理鹽水重新分散，槍頭打勻，超聲波破碎，一般一瓶動(dòng)物細(xì)胞加1mL生理鹽水，一般用總工作時(shí)間300S,，開5S，停10S，槽溫度稍設(shè)高點(diǎn)，一般50℃（此溫度與你EP管內(nèi)的溫度無關(guān)，但是溫度探針伸到反應(yīng)體系中的溫度就得設(shè)低些），20%功率。破碎完后4℃，12000轉(zhuǎn)，5min 離心（看底部的沉淀多少，破碎完全的沉淀應(yīng)該是很少的，如果還很多，重新打散后加時(shí)間再破碎）。將上清取出搖勻后檢測(cè)蛋白濃度，我用的是考馬斯亮藍(lán)+BSA法。然后蛋白用于即時(shí)檢測(cè)，暫時(shí)不用的話立刻凍在-80℃，可保存2~3天，但破碎后的蛋白最好當(dāng)天檢測(cè)，不然活性會(huì)受到影響。 |
4樓2014-05-29 18:43:51
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