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藍默兒金蟲 (小有名氣)
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[求助]
夾心ELISA，陰性值、空白值過高。 已有4人參與
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一、酶標抗體是我自己的標記的，用原核表達的蛋白（1微克/ml）包被驗證，同時設空白對照，酶標抗體稀釋1：:10000時，OD值=1.0， 建夾心ELISA方法：1.用方陣法確定多抗和酶標抗體稀釋濃度都為1:2000時，OD值=1.0左右 2.鼠源多抗包被（稀釋度1:2000）；封閉液為5%脫脂乳封閉，37°，2h；抗原為純化的蛋白（2微克/ml，），同時設陰性對照（胎牛血清），空白對照（PBS）；用標記的酶標抗體進行檢測（稀釋度1:2000），之后TMB顯色，終止讀數(shù)。陽性OD值=1.0左右，陰性OD值=0.8左右、空白OD值=0.8左右。 3，為什么陰性值，空白值那么高，難到酶標單抗與多抗反應了，不應該啊？鼠源多抗和鼠源單抗反應了？ 4，感覺也不是封閉液的問題，板子不包被，直接封閉液為5%脫脂乳封閉，37°，2h，加酶標抗體進行檢測，OD值=0.15以下。 之后我又用單抗包被，結(jié)果一樣：陰性、空白值好高。 1.包被：將三種單抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀釋，做三個平行，4°過夜。 2.第二天洗滌4次，每次3min，拍干。5%脫脂乳封閉，37°，2h。 3.洗滌4次，每次3min，拍干。加抗原（為純化好的原核表達蛋白）稀釋濃度為2微克/ml，同時設陰性對照（胎牛血清1：100稀釋），空白對照（PBS溶液)。37°，1h。 4.洗滌4次，每次3min，拍干。加酶標抗體（1:1000稀釋），37°，1h。 5.洗滌4次，每次3min，拍干。加TMB顯色，每孔100微升。37°，10min。 6.2M硫酸終止， 7.OD450讀數(shù)。 結(jié)果，陽性值2.5，陰性對照和空白值很高可達到1.5。 之后我又用細胞上清包被，其他和上面一樣，加酶標抗體（1:1000稀釋），封閉用的是1%明膠和2%的BSA，2%的BSA封閉：陰性值1.8，陽性和空白值都在2.0以上。1%明膠封閉：陰性值1.0，陽性和空白值都在2.0以上 |
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