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王志艷5新蟲 (初入文壇)
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病毒的分離純化 已有4人參與
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| 病毒的分離純化都有什么方法 具體步驟 |
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病毒的大規(guī)模純化技術(shù) 現(xiàn)代病毒研究往往需要大量的純病毒粒子，以便于化學(xué)研究或制備抗體。在這里我們簡明地描述一下脊髓灰質(zhì)炎病毒（Polio virus）的純化步驟。它是一種已被廣泛研究的危害人體健康的病毒。 在開展人體病毒實驗工作以前，讓實驗工作人員獲得抵抗這種病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗很容易獲得，大多數(shù)工作人員可能已經(jīng)獲得免疫，但重新免疫是必要的預(yù)防措施。 病毒的純化步驟主要是：1.在大規(guī)模的裝置中培養(yǎng)病毒；2.去除富含病毒培養(yǎng)液；3.通過沉淀將病毒濃縮；4.通過密度梯度離心最終純化病毒�，F(xiàn)在我們講解每個步驟的一些細(xì)節(jié)。 1.在大型裝置中培養(yǎng)細(xì)菌。為獲得足夠的用于化學(xué)研究的病毒，必須制備大量病毒。每種病毒的培養(yǎng)都有不同的步驟。脊髓灰質(zhì)炎病毒是在人或靈長類動物細(xì)胞系中培養(yǎng)的，可以培養(yǎng)在一大瓶中沿壁生長的單層細(xì)胞上，也可以在一個輕輕攪拌的細(xì)胞懸液中。在有利病毒生長的條件下，每個宿主細(xì)胞能生產(chǎn)10～1000的感染單位的病毒，即每毫升一個感染單位的滴度（或稱效價---抗血清或抗體仍能產(chǎn)生可觀察到的標(biāo)準(zhǔn)免疫反應(yīng)時的稀釋度。如抗血清的效價為1:1000，即抗血清稀釋1000倍時仍能產(chǎn)生可觀察到的免疫反應(yīng)。）。 2.富含病毒培養(yǎng)液的去除。病毒的生長和釋放伴隨著細(xì)胞的破損。在病毒復(fù)制完成的時候，培養(yǎng)液中大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)變成了細(xì)胞碎片。為使所有病毒分子完全釋放，要通過反復(fù)冷凍—融化的循環(huán)過程使細(xì)胞進(jìn)一步破碎。然后將富含病毒的液體從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到離心試管中。低速離心除去大分子的細(xì)胞殘骸。 3.通過沉淀將病毒物質(zhì)濃縮。由于病毒是蛋白質(zhì)性質(zhì)的，它們能通過蛋白質(zhì)沉淀法沉淀。脊髓灰質(zhì)炎病毒可通過高濃度的NH4Cl（每毫升培養(yǎng)液中加0.4g）沉淀下來。這一過程要在低溫下進(jìn)行，NH4Cl要在攪拌下緩慢加到培養(yǎng)液中。由于病毒蛋白沉降，溶液將變得渾濁。將沉淀物通過低速離心（2000g，1-2hr）。然后將含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸鹽緩沖液中再次懸浮培養(yǎng)。這一步驟可濃縮病毒大約10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通過密度梯度離心最終純化病毒。脊髓灰質(zhì)炎病毒可以通過蔗糖或CsCl（密度一梯度離心是一種離心新技術(shù)，可以將質(zhì)量差異微小的分子分開。用氯化銫濃鹽液，以105g以上的強(qiáng)大離心力的作用，鹽的分子被甩到離心管的底部。同時，擴(kuò)散作用使溶液中Cs＋和Cl－離子呈分散狀態(tài)，與離心力的方向相反，經(jīng)過長時間的離心，溶液達(dá)到一種平衡狀態(tài)。反向擴(kuò)散力與沉降力之間的平衡作用，產(chǎn)生了一個連續(xù)的CsCl濃度梯度。離心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA分子溶于CsCl溶液中，經(jīng)過離心，將逐漸集中在一條狹窄的帶上。帶上的DNA分子密度與該處CsCl相等。）的密度梯度離心純化。在后者中，病毒在離心試管中成為一個分離帶，這一過程與對DNA的分離相同，離心須要高速，即120000g,且要進(jìn)行好幾個小時，最好是一整夜。離心管中的液體通過試管底部的一點點滴出來，要檢測每一滴的病毒滴度。在合適的離心條件下，所有的病毒分子都集聚在一或兩個組分中，所以它們是非常純的。結(jié)晶脊髓灰質(zhì)炎病毒。如果能在合適的條件下濃縮大量且高純度的病毒，就可以獲得病毒晶體。這種晶體為化學(xué)分析提供了很好的材料，且易于通過X射線衍射技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 |
9樓2015-09-06 16:54:09
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噬斑純化 1.將收取的病毒于－80 ℃和37 ℃ 之間反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心15 min，0.45μm濾器過濾。 2.吸取200 μL病毒上清液以DMEM依次稀釋成104-108倍 5個濃度梯度，將這5個濃度的病毒上清稀釋液各200 μL 分別接種于3-5×105/孔vero細(xì)胞中（提前一天接種，保證第二天到80-90%融合）（六孔板） 3.37 ℃ 孵育1.0-2.0 h，吸出病毒上清液，每孔加入1 mL覆蓋液（2×DMEM與1.0%的低熔點瓊脂糖等量混合，三蒸水溶解），繼續(xù)培養(yǎng)直至噬斑形成。 注意：配制好的瓊脂糖液在120度，20分鐘高壓滅菌，并立即放到45度－47度的水浴中，隔幾分鐘晃動一次以確保均勻熔化。 4.熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況。 5.挑取GFP表達(dá)陽性的噬斑，反復(fù)凍融，離心后再次感染vero 細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變效應(yīng)時回收細(xì)胞。（此步驟重復(fù)做至少3-5次） |
10樓2015-09-06 16:56:30
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