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王志艷5新蟲 (初入文壇)
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病毒的分離純化 已有4人參與
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| 病毒的分離純化都有什么方法 具體步驟 |
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鳶飛歷天
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病毒的大規(guī)模純化技術(shù) 現(xiàn)代病毒研究往往需要大量的純病毒粒子，以便于化學(xué)研究或制備抗體。在這里我們簡明地描述一下脊髓灰質(zhì)炎病毒（Polio virus）的純化步驟。它是一種已被廣泛研究的危害人體健康的病毒。 在開展人體病毒實(shí)驗(yàn)工作以前，讓實(shí)驗(yàn)工作人員獲得抵抗這種病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗很容易獲得，大多數(shù)工作人員可能已經(jīng)獲得免疫，但重新免疫是必要的預(yù)防措施。 病毒的純化步驟主要是：1.在大規(guī)模的裝置中培養(yǎng)病毒；2.去除富含病毒培養(yǎng)液；3.通過沉淀將病毒濃縮；4.通過密度梯度離心最終純化病毒�，F(xiàn)在我們講解每個(gè)步驟的一些細(xì)節(jié)。 1.在大型裝置中培養(yǎng)細(xì)菌。為獲得足夠的用于化學(xué)研究的病毒，必須制備大量病毒。每種病毒的培養(yǎng)都有不同的步驟。脊髓灰質(zhì)炎病毒是在人或靈長類動物細(xì)胞系中培養(yǎng)的，可以培養(yǎng)在一大瓶中沿壁生長的單層細(xì)胞上，也可以在一個(gè)輕輕攪拌的細(xì)胞懸液中。在有利病毒生長的條件下，每個(gè)宿主細(xì)胞能生產(chǎn)10～1000的感染單位的病毒，即每毫升一個(gè)感染單位的滴度（或稱效價(jià)---抗血清或抗體仍能產(chǎn)生可觀察到的標(biāo)準(zhǔn)免疫反應(yīng)時(shí)的稀釋度。如抗血清的效價(jià)為1:1000，即抗血清稀釋1000倍時(shí)仍能產(chǎn)生可觀察到的免疫反應(yīng)。）。 2.富含病毒培養(yǎng)液的去除。病毒的生長和釋放伴隨著細(xì)胞的破損。在病毒復(fù)制完成的時(shí)候，培養(yǎng)液中大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)變成了細(xì)胞碎片。為使所有病毒分子完全釋放，要通過反復(fù)冷凍—融化的循環(huán)過程使細(xì)胞進(jìn)一步破碎。然后將富含病毒的液體從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到離心試管中。低速離心除去大分子的細(xì)胞殘骸。 3.通過沉淀將病毒物質(zhì)濃縮。由于病毒是蛋白質(zhì)性質(zhì)的，它們能通過蛋白質(zhì)沉淀法沉淀。脊髓灰質(zhì)炎病毒可通過高濃度的NH4Cl（每毫升培養(yǎng)液中加0.4g）沉淀下來。這一過程要在低溫下進(jìn)行，NH4Cl要在攪拌下緩慢加到培養(yǎng)液中。由于病毒蛋白沉降，溶液將變得渾濁。將沉淀物通過低速離心（2000g，1-2hr）。然后將含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸鹽緩沖液中再次懸浮培養(yǎng)。這一步驟可濃縮病毒大約10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。 4.通過密度梯度離心最終純化病毒。脊髓灰質(zhì)炎病毒可以通過蔗糖或CsCl（密度一梯度離心是一種離心新技術(shù)，可以將質(zhì)量差異微小的分子分開。用氯化銫濃鹽液，以105g以上的強(qiáng)大離心力的作用，鹽的分子被甩到離心管的底部。同時(shí)，擴(kuò)散作用使溶液中Cs＋和Cl－離子呈分散狀態(tài)，與離心力的方向相反，經(jīng)過長時(shí)間的離心，溶液達(dá)到一種平衡狀態(tài)。反向擴(kuò)散力與沉降力之間的平衡作用，產(chǎn)生了一個(gè)連續(xù)的CsCl濃度梯度。離心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA分子溶于CsCl溶液中，經(jīng)過離心，將逐漸集中在一條狹窄的帶上。帶上的DNA分子密度與該處CsCl相等。）的密度梯度離心純化。在后者中，病毒在離心試管中成為一個(gè)分離帶，這一過程與對DNA的分離相同，離心須要高速，即120000g,且要進(jìn)行好幾個(gè)小時(shí)，最好是一整夜。離心管中的液體通過試管底部的一點(diǎn)點(diǎn)滴出來，要檢測每一滴的病毒滴度。在合適的離心條件下，所有的病毒分子都集聚在一或兩個(gè)組分中，所以它們是非常純的。結(jié)晶脊髓灰質(zhì)炎病毒。如果能在合適的條件下濃縮大量且高純度的病毒，就可以獲得病毒晶體。這種晶體為化學(xué)分析提供了很好的材料，且易于通過X射線衍射技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。 |
9樓2015-09-06 16:54:09
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