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[求助]
包涵體上鎳離子柱純化后，洗脫收集的液體中目的蛋白不見了 已有4人參與
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我的目的蛋白帶有his標簽，8M尿素溶解包涵體， 純化時binding buffer:7M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH8.0; Washing buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH6.3; Elution buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH4.5; 結果洗脫收集的液體中沒有目的蛋白，連strip buffer(EDTA)后收集的液體也沒有。 怎么回事，純化之前蛋白電泳檢測是存在目的蛋白的，但純化后竟然沒蛋白了。求助各位大神了 |
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 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 | 蛋白表達純化與檢測 |
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2樓2014-07-14 11:02:46
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6樓2014-07-16 17:05:52
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【答案】應助回帖
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若確定沒有洗脫下來，請依次檢查 1.洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質(zhì)仍然結合在柱上，結合力較強） 解決方法：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。 2.降低PH的方法洗脫的,因為若pH低于3.5,會導致鎳離子脫落 解決方法：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫 3.蛋白已沉淀在柱上 解決方法：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4－8 M脲，或4－6 M 鹽酸胍)。 4.可能原因：非特異性疏水或其他相互反應 解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的濃度。 以上方法都不靈，那么只能重新設計His尾：1.適當減少His尾中的His殘基的數(shù)量；2.His尾與蛋白質(zhì)本體之間構建專一性的酶切位點，比如凝血酶位點，注意：His尾與蛋白質(zhì)本體之間要留下5-6個親水的氨基酸片段，以防止引起蛋白質(zhì)異常折疊和遮蓋酶切位點。 |
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王小七wq7樓2014-07-17 03:58:00
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