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amq7392

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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[求助] 求教離子交換柱純化蛋白的問(wèn)題

本人用DEAE Sepharose FF純化一種酶，柱子為1.6X30cm，柱床高約20cm，上樣緩沖液20mM Tris-HCl，用0—0.5M NaCl梯度洗脫，流速約2ml/min。問(wèn)題是：在整個(gè)梯度洗脫過(guò)程中僅出現(xiàn)一個(gè)很大的峰，峰高A280不到0.02，但特別寬，三四個(gè)小時(shí)才出完，經(jīng)檢測(cè)酶活，我的目標(biāo)產(chǎn)物就存在于整個(gè)峰中。我重復(fù)了兩三次，都是這種情況，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事？是我裝柱有問(wèn)題還是洗脫條件有問(wèn)題？還有就是，當(dāng)梯度完后，高鹽洗脫時(shí)（1M NaCl），柱床高度下降明顯，有兩三個(gè)厘米，這是怎么回事呢？謝謝各位！

[ Last edited by amq7392 on 2012-3-13 at 19:24 ]

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1樓 2012-03-13 19:20:20

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baodongq

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28樓2012-03-16 17:00:15

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【答案】應(yīng)助回帖

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應(yīng)該是緩沖體系的PH的問(wèn)題，你調(diào)一下緩沖體系的PH改變，重新嘗試一下，應(yīng)該就能掛柱了

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2樓2012-03-14 21:32:20

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lihuan0525

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高鹽洗脫時(shí)（1M NaCl），柱床高度下降明顯，有兩三個(gè)厘米，這是怎么回事呢？感覺(jué)是你的柱子沒(méi)有裝好，重裝下柱子試試吧，如果還不行的話，在考慮別的問(wèn)題。在有上樣的流速可以減小點(diǎn)。

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3樓2012-03-14 22:30:15

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確定一下是否是DEAE sep ff
聽(tīng)著怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氫氧化鈉處理過(guò)，包括乙醇、酸我均用過(guò)在線清洗，也沒(méi)見(jiàn)有床體積變化。

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4樓2012-03-15 08:46:51

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yuanbo934

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【答案】應(yīng)助回帖

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再過(guò)柱子之前應(yīng)該讓緩沖液過(guò)上一夜，把柱子里的填料壓實(shí)。建議用5%梯度洗脫，這樣每個(gè)梯度，應(yīng)該有個(gè)峰。

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7樓2012-03-15 08:58:27

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6樓: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 08:52:28:
重裝過(guò)幾次，都是這種情況，柱床塌陷，流速變得很慢，三四秒一滴。跑出來(lái)的峰都是這樣：一個(gè)很低很寬的大峰。線性梯度太緩會(huì)不會(huì)導(dǎo)致峰變寬呢？梯度陡一些會(huì)不會(huì)改善峰形？

請(qǐng)問(wèn)你的目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)多少，你用的緩沖液的PH是多少，一般離子交換的ph和等電點(diǎn)相差一個(gè)ph

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11樓2012-03-15 12:52:40

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13樓: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 13:02:42:
文獻(xiàn)中報(bào)道的這種酶的等電點(diǎn)從4點(diǎn)幾到6點(diǎn)幾不等，不同菌種產(chǎn)的酶是不太一樣的，我也不清楚我的酶等電點(diǎn)多少。我開(kāi)始用pH6.5的磷酸緩沖液，發(fā)現(xiàn)穿透峰有酶活，掛柱不牢，故改為pH8.0的Tris-HCl。

先把等電點(diǎn)弄清楚了吧，這樣的話你摸條件的時(shí)候也容易點(diǎn)

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14樓2012-03-15 13:10:35

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1、很明顯，你的柱子沒(méi)有裝好，但即使這樣也不至于出現(xiàn)你描述的問(wèn)題；
2、你的梯度洗脫液描述的很模糊，但也不會(huì)出現(xiàn)你說(shuō)的問(wèn)題；
我覺(jué)得最有可能的是你的樣品量太小，柱子太大了。最好檢查下檢測(cè)器有沒(méi)有問(wèn)題。

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26樓2012-03-16 10:48:55

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9樓: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 09:40:14:
過(guò)一夜會(huì)消耗N升緩沖液啊，呵呵�！�5%梯度洗脫”啥意思？

平衡是要幾倍柱體積的，是不沒(méi)有平衡過(guò)來(lái)啊，確定上樣前平衡液的ph是目的ph？

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10樓2012-03-15 11:43:12

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