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董莊青年新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR目的條帶太弱 并無非特異性條帶 怎樣改進可以使目的產(chǎn)物的量加大 已有7人參與
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最近做PCR很郁悶 如圖： 目的條帶（上面 淺淺的）太弱 引物二聚體（下面)很亮 PCR條件優(yōu)化時要么帶很淺 要么沒有帶 最后優(yōu)化成下圖所示 帶一直很淺 求解 先謝謝各位！��！ 引物是生工剛合成的 模板是新提的 帶都很亮 PCR體系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20個循環(huán):  :cat39 |
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zhangyunjing
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-18 10:29:22
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-18 10:29:22
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看你的引物，正反向是互補的，是做定點突變嗎？如果做定點突變的話，給你推薦一個在線設(shè)計軟件，我做過多次點突變，用這個軟件設(shè)計的引物擴的都很好。QuikChange Primer Design。鏈接：https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp 另外，如果做定點突變的話，需要采用保真性高的KOD或者Pfu酶，Taq酶做定點突變不行的 |
35樓2014-07-17 16:36:57
zhangyunjing
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【答案】應(yīng)助回帖
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董莊青年: 金幣+1 2014-07-16 12:08:46
gyesang: 金幣+2, 應(yīng)助指數(shù)+1, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-16 13:03:16
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董莊青年: 金幣+1 2014-07-16 12:08:46
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引物設(shè)計的不好，大部分引物都形成引物二聚體了，擴增效率肯定低，不放把引物序列傳上，幫你分析一下引物的質(zhì)量如何。 另外，擴增的目的條帶是多大？延伸時間設(shè)置6 min，循環(huán)數(shù)20 cycles，感覺延伸時間太長，循環(huán)數(shù)偏少，可以設(shè)置到30-35 cycles。 如果你進行長片段擴增的話，有專門的長片段試劑盒，擴增效率很高的。 |
2樓2014-07-16 11:35:14
董莊青年
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3樓2014-07-16 12:22:21
董莊青年
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4樓2014-07-16 14:14:47
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