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董莊青年新蟲 (初入文壇)
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PCR目的條帶太弱 并無非特異性條帶 怎樣改進(jìn)可以使目的產(chǎn)物的量加大 已有7人參與
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最近做PCR很郁悶 如圖： 目的條帶（上面 淺淺的）太弱 引物二聚體（下面)很亮 PCR條件優(yōu)化時要么帶很淺 要么沒有帶 最后優(yōu)化成下圖所示 帶一直很淺 求解 先謝謝各位�。。� 引物是生工剛合成的 模板是新提的 帶都很亮 PCR體系(25ul)：10×buffer: 2.5ul dNTP-MIX(10mM): 0.5ul 引物（10um)：各1.5ul 模板（4kb): 1ul（150ng左右） Tap DNA Polymerase(5U/ul): 0.5 ul 水:17.5ul PCR程序：94℃ 5min; 94℃ 1min; 58℃ 1min;72℃ 6min;72℃ 10min；共20個循環(huán):  :cat39 |
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凌波麗
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模板為4kd，長片段PCR為好。 長片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 2014-7-11 3kd-20kd的DNA片段適用長片段PCR擴(kuò)增。 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無糾錯功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了20kd,甜茶堿可以少加點。 3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時間要短，尤其是一般不超過30 s，尤其是模板長度超過8KD時更是如此，變性時間長會破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時加長延伸反應(yīng)時間，長度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時間為5-10分鐘，長度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時間為20分鐘，樓主的PCR的延伸反應(yīng)時間可能為12-16分鐘左右。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應(yīng)用長片段PCR緩沖溶液。10X長片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設(shè)計較長的PCR引物（25-30 bp) 其他同普通PCR。 |
19樓2014-07-17 00:08:05
zhangyunjing
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引物設(shè)計的不好，大部分引物都形成引物二聚體了，擴(kuò)增效率肯定低，不放把引物序列傳上，幫你分析一下引物的質(zhì)量如何。 另外，擴(kuò)增的目的條帶是多大？延伸時間設(shè)置6 min，循環(huán)數(shù)20 cycles，感覺延伸時間太長，循環(huán)數(shù)偏少，可以設(shè)置到30-35 cycles。 如果你進(jìn)行長片段擴(kuò)增的話，有專門的長片段試劑盒，擴(kuò)增效率很高的。 |
2樓2014-07-16 11:35:14
代德艷
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6樓2014-07-16 15:45:37
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10樓2014-07-16 17:20:22
rodickholm
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13樓2014-07-16 19:56:40
rodickholm
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15樓2014-07-16 20:24:48
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滾環(huán)PCR直接擴(kuò)載體？做定點突變的吧。。 1.引物不夠長，你這種PCR退火溫度至少得60甚至65度以上，必須要保證你的引物和模板的高特異性，一般的說明書上都建議兩步PCR。溫度越低引物二聚體越多。 2.你的酶得換換了，延伸速度太慢，至少換30s/1kb的保真酶，一般的酶不能勝任這個PCR 3.你的這個PCR后期轉(zhuǎn)化真正需要的并不是上面那條帶，而是帶缺刻的環(huán)狀DNA，上面那條帶屬于線性指數(shù)擴(kuò)增的二聯(lián)體引物條帶，越多越不利于你后期轉(zhuǎn)化后的篩選。 4.你擴(kuò)完是不是需要用甲基化識別位點的限制性內(nèi)切酶處理模板��？處理完不要純化了，適當(dāng)稀釋后直接轉(zhuǎn)化就好，測序的時候多挑幾個轉(zhuǎn)化子，會有引物二聯(lián)體，甚至三聯(lián)體引物的假陽性出現(xiàn)。 |
20樓2014-07-17 03:59:40
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26樓2014-07-17 11:06:56
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-18 10:29:22
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看你的引物，正反向是互補的，是做定點突變嗎？如果做定點突變的話，給你推薦一個在線設(shè)計軟件，我做過多次點突變，用這個軟件設(shè)計的引物擴(kuò)的都很好。QuikChange Primer Design。鏈接：https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp 另外，如果做定點突變的話，需要采用保真性高的KOD或者Pfu酶，Taq酶做定點突變不行的 |
35樓2014-07-17 16:36:57
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