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1樓 2014-07-25 21:05:14

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dqtianbin(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-28 08:41:39

引用回帖:

8樓: Originally posted by 蜂鳥404 at 2014-07-26 23:01:53
我有個(gè)問題想問一下，做共沉淀后，把結(jié)合染色質(zhì)DNA的蛋白質(zhì)用蛋白酶處理后，理論上剩下一些被超生打斷的無數(shù)小片段，因?yàn)榇驍嗍请S機(jī)的，所以會有很多噪音，當(dāng)然這些序列會有重復(fù)，只有通過高通量測序?qū)⒅貜?fù)比對才能 ...

ChIP的主要用途是確定DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）是否與基因的某部位結(jié)合。以轉(zhuǎn)錄因子A舉例說明：
轉(zhuǎn)錄因子A一定有許多受其調(diào)節(jié)的靶基因，假定你懷疑B基因可能是轉(zhuǎn)錄因子A的靶基因，那么你要回答的問題首先是A對B在轉(zhuǎn)錄水平上有直接調(diào)節(jié)作用；然后是回答A是否與B的調(diào)控區(qū)域（增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域）結(jié)合，只有結(jié)合了才會在轉(zhuǎn)錄水平上對B調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因相互作用一般都通過一段concensus順序，即所謂的response elements實(shí)現(xiàn)的，所以在回答此問題之前，要對靶基因B的調(diào)控區(qū)進(jìn)行分析，看有無轉(zhuǎn)錄因子A的可能結(jié)合順序，一般可能不只一個(gè)，如果有這樣的順序，就更加支持B是A的靶基因的判斷。接下來就要具體研究A與B調(diào)控區(qū)域的結(jié)合情況，此時(shí)就用的ChIP assay. 具體說，用A的抗體進(jìn)行IP，然后用B調(diào)控區(qū)中含有A結(jié)合的response elements附近的上下游引物對沉淀物中的DNA進(jìn)行PCR。如果有產(chǎn)物就證實(shí)A與B的調(diào)控區(qū)結(jié)合。當(dāng)然需要有對照，對照可以采用距離response elements有一段距離的上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。理論上對照引物是不該有擴(kuò)增產(chǎn)物的。到此為止，就把所要回答的問題回答了。當(dāng)然，嚴(yán)格說來，實(shí)驗(yàn)還沒有結(jié)束，還應(yīng)該用B調(diào)控區(qū)域做一個(gè)reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection觀察轉(zhuǎn)錄因子A對B基因調(diào)控區(qū)所控制的報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)情況，具體說，如果所用response elements是野生型，則該reporter會受A的調(diào)控，若是突變型，則不再手A的調(diào)控。至此，整個(gè)問題算是大致完整解決了。

除了主要上述應(yīng)用之外，偶爾也可以用于尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。仍以上述轉(zhuǎn)錄因子A為例，為了尋找A的靶基因，可以用A的抗體做IP，然后將所獲得的DNA片段進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測定，最后按照A的concensus response elements進(jìn)行分析所得到的諸多克隆是否含有A的結(jié)合位點(diǎn)而篩出A的可能靶基因（調(diào)控區(qū)）。這部分也許是你所理解的內(nèi)容？

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9樓2014-07-28 03:19:11

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【答案】應(yīng)助回帖

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-25 22:28:34
gyesang: 回帖置頂 2014-07-25 22:28:36
dqtianbin: 金幣+5, ★★★很有幫助, 我們實(shí)驗(yàn)室在做一個(gè)類似的摸索，他們覺得CHIP太貴了，所以在3C基礎(chǔ)上做一個(gè)比較便宜的實(shí)驗(yàn)，好像也能達(dá)到目的，但是一年過了一直沒有成功，于是有陰影了。如您說，這個(gè)PULL DOWN的抗體看來很重要，自己做的抗體應(yīng)該不行吧，要是沒有商品化的怎么辦 2014-07-26 09:13:12

試劑盒不試劑盒都不是問題。如果你對IP熟悉就更不是問題了。ChIP assay就是一個(gè)IP實(shí)驗(yàn)，完了之后做PCR。本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵不是IP本身，而是對DNA的超聲處理。只要這一步做的好，其他完全取決于所用抗體的好壞了。由于在ChIP前細(xì)胞做了cross－link處理，所以在超聲時(shí)和普通細(xì)胞是不同的，具體要自己好好摸索一下：自己超聲儀器功率的設(shè)定、超聲時(shí)間、時(shí)間間隔、超聲次數(shù)等等，還有細(xì)胞cross－link的時(shí)間等等，這些都與超聲效果有關(guān)系。二后者直接決定了你后續(xù)ChIP的結(jié)果。當(dāng)然在買抗體時(shí)如果可能最好買ChIP級別的，或者他人有成功使用者的。
祝好運(yùn)！

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2樓2014-07-25 22:11:38

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 17:00:44

自己做的抗體不一定就不行的，這個(gè)無法判斷，只有做了才知道。
其實(shí)ChIP沒有什么貴的，就是需要抗體。其他都是常規(guī)的東西。真的不需要試劑盒，無非幾個(gè)緩沖液而已。再就是PCR，也無需要多少錢的。

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3樓2014-07-26 10:16:09

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4樓2014-07-26 11:29:37

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流經(jīng)驗(yàn)！ 2014-07-26 19:26:45

引用回帖:

4樓: Originally posted by dqtianbin at 2014-07-25 22:29:37
如果外包呢，大概花費(fèi)多少錢呢？您應(yīng)該自己做過吧，在病毒與細(xì)胞之間的研究您有做過嗎...

我們這里是常規(guī)實(shí)驗(yàn)之一。未曾外包過。
我們的對象注意是轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的相互作用。

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5樓2014-07-26 11:33:29

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6樓2014-07-26 12:26:22

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dqtianbin: 金幣+5, ★★★很有幫助, 恩，先謝過了，到做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候定請教您 2014-07-26 13:38:51

引用回帖:

6樓: Originally posted by dqtianbin at 2014-07-25 23:26:22
敢問您在哪個(gè)實(shí)驗(yàn)室呢？挺牛啊。那看來您那邊已經(jīng)很成熟了，是否可以合作來您那兒學(xué)習(xí)啊...

只是一種方法而已，和牛無關(guān)。
有什么具體問題可以發(fā)給我，我則盡我所能。

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7樓2014-07-26 12:30:17

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2014-07-28 08:41:32

引用回帖:

5樓: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-26 11:33:29
我們這里是常規(guī)實(shí)驗(yàn)之一。未曾外包過。
我們的對象注意是轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的相互作用。...

我有個(gè)問題想問一下，做共沉淀后，把結(jié)合染色質(zhì)DNA的蛋白質(zhì)用蛋白酶處理后，理論上剩下一些被超生打斷的無數(shù)小片段，因?yàn)榇驍嗍请S機(jī)的，所以會有很多噪音，當(dāng)然這些序列會有重復(fù)，只有通過高通量測序?qū)⒅貜?fù)比對才能確定具體的結(jié)合序列，不過這樣太麻煩，用pcr怎么確定

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8樓2014-07-27 12:01:53

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引用回帖:

9樓: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-28 03:19:11
ChIP的主要用途是確定DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）是否與基因的某部位結(jié)合。以轉(zhuǎn)錄因子A舉例說明：
轉(zhuǎn)錄因子A一定有許多受其調(diào)節(jié)的靶基因，假定你懷疑B基因可能是轉(zhuǎn)錄因子A的靶基因，那么你要回答的問題首先是A對 ...

多謝大神回答，受益匪淺，確實(shí)如你所言，我現(xiàn)在確定要研究一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（細(xì)菌中的，可能調(diào)控了一些毒力基因），現(xiàn)在想找它所直接調(diào)控的基因，于是我想到了共沉淀然后高通量測序，可是后來因?yàn)榭贵w效果不好，背景太高，失敗了，我想問一下，像我這種情況，不是用來驗(yàn)證而是去尋找下游直接調(diào)控基因的，有沒有什么更有效的方法

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10樓2014-07-28 13:23:03

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