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分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累

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1樓 2014-07-25 21:05:14

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至尊木蟲 (知名作家)

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dqtianbin(kx444555代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)交流 2014-07-28 08:41:39

引用回帖:

8樓: Originally posted by 蜂鳥404 at 2014-07-26 23:01:53
我有個(gè)問(wèn)題想問(wèn)一下，做共沉淀后，把結(jié)合染色質(zhì)DNA的蛋白質(zhì)用蛋白酶處理后，理論上剩下一些被超生打斷的無(wú)數(shù)小片段，因?yàn)榇驍嗍请S機(jī)的，所以會(huì)有很多噪音，當(dāng)然這些序列會(huì)有重復(fù)，只有通過(guò)高通量測(cè)序?qū)⒅貜?fù)比對(duì)才能 ...

ChIP的主要用途是確定DNA結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）是否與基因的某部位結(jié)合。以轉(zhuǎn)錄因子A舉例說(shuō)明：
轉(zhuǎn)錄因子A一定有許多受其調(diào)節(jié)的靶基因，假定你懷疑B基因可能是轉(zhuǎn)錄因子A的靶基因，那么你要回答的問(wèn)題首先是A對(duì)B在轉(zhuǎn)錄水平上有直接調(diào)節(jié)作用；然后是回答A是否與B的調(diào)控區(qū)域（增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域）結(jié)合，只有結(jié)合了才會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)B調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因相互作用一般都通過(guò)一段concensus順序，即所謂的response elements實(shí)現(xiàn)的，所以在回答此問(wèn)題之前，要對(duì)靶基因B的調(diào)控區(qū)進(jìn)行分析，看有無(wú)轉(zhuǎn)錄因子A的可能結(jié)合順序，一般可能不只一個(gè)，如果有這樣的順序，就更加支持B是A的靶基因的判斷。接下來(lái)就要具體研究A與B調(diào)控區(qū)域的結(jié)合情況，此時(shí)就用的ChIP assay. 具體說(shuō)，用A的抗體進(jìn)行IP，然后用B調(diào)控區(qū)中含有A結(jié)合的response elements附近的上下游引物對(duì)沉淀物中的DNA進(jìn)行PCR。如果有產(chǎn)物就證實(shí)A與B的調(diào)控區(qū)結(jié)合。當(dāng)然需要有對(duì)照，對(duì)照可以采用距離response elements有一段距離的上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。理論上對(duì)照引物是不該有擴(kuò)增產(chǎn)物的。到此為止，就把所要回答的問(wèn)題回答了。當(dāng)然，嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，實(shí)驗(yàn)還沒(méi)有結(jié)束，還應(yīng)該用B調(diào)控區(qū)域做一個(gè)reporter gene（包括respnse elements wild-type和mutants），然后用transient transfection觀察轉(zhuǎn)錄因子A對(duì)B基因調(diào)控區(qū)所控制的報(bào)告基因表達(dá)的誘導(dǎo)情況，具體說(shuō)，如果所用response elements是野生型，則該reporter會(huì)受A的調(diào)控，若是突變型，則不再手A的調(diào)控。至此，整個(gè)問(wèn)題算是大致完整解決了。

除了主要上述應(yīng)用之外，偶爾也可以用于尋找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。仍以上述轉(zhuǎn)錄因子A為例，為了尋找A的靶基因，可以用A的抗體做IP，然后將所獲得的DNA片段進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定，最后按照A的concensus response elements進(jìn)行分析所得到的諸多克隆是否含有A的結(jié)合位點(diǎn)而篩出A的可能靶基因（調(diào)控區(qū)）。這部分也許是你所理解的內(nèi)容？

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9樓2014-07-28 03:19:11

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至尊木蟲 (知名作家)

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-25 22:28:34
gyesang: 回帖置頂 2014-07-25 22:28:36
dqtianbin: 金幣+5, ★★★很有幫助, 我們實(shí)驗(yàn)室在做一個(gè)類似的摸索，他們覺(jué)得CHIP太貴了，所以在3C基礎(chǔ)上做一個(gè)比較便宜的實(shí)驗(yàn)，好像也能達(dá)到目的，但是一年過(guò)了一直沒(méi)有成功，于是有陰影了。如您說(shuō)，這個(gè)PULL DOWN的抗體看來(lái)很重要，自己做的抗體應(yīng)該不行吧，要是沒(méi)有商品化的怎么辦 2014-07-26 09:13:12

試劑盒不試劑盒都不是問(wèn)題。如果你對(duì)IP熟悉就更不是問(wèn)題了。ChIP assay就是一個(gè)IP實(shí)驗(yàn)，完了之后做PCR。本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵不是IP本身，而是對(duì)DNA的超聲處理。只要這一步做的好，其他完全取決于所用抗體的好壞了。由于在ChIP前細(xì)胞做了cross－link處理，所以在超聲時(shí)和普通細(xì)胞是不同的，具體要自己好好摸索一下：自己超聲儀器功率的設(shè)定、超聲時(shí)間、時(shí)間間隔、超聲次數(shù)等等，還有細(xì)胞cross－link的時(shí)間等等，這些都與超聲效果有關(guān)系。二后者直接決定了你后續(xù)ChIP的結(jié)果。當(dāng)然在買抗體時(shí)如果可能最好買ChIP級(jí)別的，或者他人有成功使用者的。
祝好運(yùn)！

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2樓2014-07-25 22:11:38

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 17:00:44

自己做的抗體不一定就不行的，這個(gè)無(wú)法判斷，只有做了才知道。
其實(shí)ChIP沒(méi)有什么貴的，就是需要抗體。其他都是常規(guī)的東西。真的不需要試劑盒，無(wú)非幾個(gè)緩沖液而已。再就是PCR，也無(wú)需要多少錢的。

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3樓2014-07-26 10:16:09

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dqtianbin

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4樓2014-07-26 11:29:37

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