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zb0806030

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[求助] 哪位大蝦幫忙分析一下real-time PCR的結(jié)果已有2人參與

附圖是我做結(jié)果，我用的Takara的Mix，每個(gè)線都是不同的引物，目的是想試一下我的引物是否好用。因?yàn)闆]有什么經(jīng)驗(yàn)，不知道是引物有問題還是模板不好導(dǎo)致的溶解曲線和擴(kuò)增曲線都不正常，哪位高手幫忙分析一下可能的原因，提點(diǎn)建議，謝謝啦！

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1樓 2014-07-29 15:36:40

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zb0806030(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-29 19:10:47

你這啥都沒有，問題就大了，模板引物不好都有可能，這根本就沒有擴(kuò)增出東西來嘛，先做個(gè)半定量，確定一下引物和模板有無問題

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2樓2014-07-29 16:36:40

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2樓: Originally posted by songzuowei at 2014-07-29 16:36:40
你這啥都沒有，問題就大了，模板引物不好都有可能，這根本就沒有擴(kuò)增出東西來嘛，先做個(gè)半定量，確定一下引物和模板有無問題

這些引物用這個(gè)模板做過RT-PCR，能擴(kuò)出條帶，大概30cycles就能出來帶了，有個(gè)別引物可能有雜帶。但大部分都還是可以擴(kuò)出來一條特異條帶的，還有可能有其它原因嗎？謝謝

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3樓2014-07-29 19:50:04

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songzuowei

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zb0806030: 金幣+2, ★有幫助 2014-07-30 09:46:28

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3樓: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-29 19:50:04
這些引物用這個(gè)模板做過RT-PCR，能擴(kuò)出條帶，大概30cycles就能出來帶了，有個(gè)別引物可能有雜帶。但大部分都還是可以擴(kuò)出來一條特異條帶的，還有可能有其它原因嗎？謝謝...

但是從你的擴(kuò)增曲線和熔解曲線上看確實(shí)是沒有擴(kuò)增出東西來，不然的話熔解曲線最起碼是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物設(shè)計(jì)上應(yīng)該不同你應(yīng)該知道吧那么是否是你的加樣體系或者退火溫度存在問題呢？你這個(gè)情況可能性太多不好判斷

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4樓2014-07-30 09:27:03

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4樓: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 09:27:03
但是從你的擴(kuò)增曲線和熔解曲線上看確實(shí)是沒有擴(kuò)增出東西來，不然的話熔解曲線最起碼是有峰的，另：做RT-PCR的引物和做qPCR的引物設(shè)計(jì)上應(yīng)該不同你應(yīng)該知道吧那么是否是你的加樣體系或者退火溫度存在問題呢？你這個(gè) ...

我們得引物都是別人文獻(xiàn)里用做real-time的引物，一般q-pcr的引物退火是不是都在60左右，因?yàn)樗嘶鸷脱由焓且徊剑?

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5樓2014-07-30 09:48:27

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先用qPCR的MIX做普通PCR，摸索一下條件。

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6樓2014-07-30 10:21:34

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附件是我今天做的RT-PCR，一共21對(duì)引物，每個(gè)泳道一對(duì)（30cycles），用的引物和模板與q-pcr一樣，那從這個(gè)結(jié)果看模板應(yīng)該沒有問題，有個(gè)別引物特異性不太好。最下面一條marker是250bp。是不是就可以確定是引物的問題？或者引物不適合做q-pcr，或者引物退火不合適？那一般q-pcr的引物退火可調(diào)的范圍都在多少度到多少度呢？謝謝啦！

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7樓2014-07-30 10:27:01

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zb0806030: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-07-30 13:54:49

引用回帖:

7樓: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 10:27:01
附件是我今天做的RT-PCR，一共21對(duì)引物，每個(gè)泳道一對(duì)（30cycles），用的引物和模板與q-pcr一樣，那從這個(gè)結(jié)果看模板應(yīng)該沒有問題，有個(gè)別引物特異性不太好。最下面一條marker是250bp。是不是就可以確定是引物的問 ...

首先從你的電泳圖上來看模板和引物基本是沒問題的，因?yàn)槟軘U(kuò)增出東西來，雜帶先不管那是你引物特異性不好，重新設(shè)計(jì)即可，但你定量熔解曲線擴(kuò)增曲線看是沒有擴(kuò)增出東西來的，建議如下：將定量后的產(chǎn)物跑電泳（2%的膠）看有無條帶；退火溫度一般都是60°；模板梯度稀釋：10倍，50倍，100倍，500倍，1000倍

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8樓2014-07-30 13:15:15

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8樓: Originally posted by songzuowei at 2014-07-30 13:15:15
首先從你的電泳圖上來看模板和引物基本是沒問題的，因?yàn)槟軘U(kuò)增出東西來，雜帶先不管那是你引物特異性不好，重新設(shè)計(jì)即可，但你定量熔解曲線擴(kuò)增曲線看是沒有擴(kuò)增出東西來的，建議如下：將定量后的產(chǎn)物跑電泳（2%的 ...

非常感謝您的幫助，我找到原因了，模板和引物都沒有問題，是pcr過程設(shè)置的問題，我們得pcr是ABI的Stepone，結(jié)果設(shè)置里面選了加Rox，把這一項(xiàng)選為none后，擴(kuò)增曲線和溶解曲線都正常了。

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厚積薄發(fā)

9樓2014-07-30 13:56:55

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9樓: Originally posted by zb0806030 at 2014-07-30 13:56:55
非常感謝您的幫助，我找到原因了，模板和引物都沒有問題，是pcr過程設(shè)置的問題，我們得pcr是ABI的Stepone，結(jié)果設(shè)置里面選了加Rox，把這一項(xiàng)選為none后，擴(kuò)增曲線和溶解曲線都正常了。...

奧不客氣難怪呢不然實(shí)在是不好分析原因

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10樓2014-07-30 14:00:35

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