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merry2004120銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
請(qǐng)幫忙看看這個(gè)PCR后電泳結(jié)果，謝謝！ 已有1人參與
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質(zhì)粒大小>7kbp。 目的基因：772bp。 引物：Tm：57°C。 按質(zhì)粒濃度設(shè)了4個(gè)梯度，每個(gè)梯度分3管，同時(shí)進(jìn)行PCR。 PCR反應(yīng)條件： 第一階段：94°C，2min 第二階段：94°C，30s；52°C，30s；72°C，47s；30個(gè)循環(huán) 第三階段：72°C，5min 加樣： 孔1：Marker D2000。孔2：產(chǎn)物加到孔外邊了。 孔3、4、5：高濃度質(zhì)粒。 孔6、7、8：中高濃度質(zhì)粒。 孔9、10、11：中低濃度質(zhì)粒。 孔12、13、14：低濃度質(zhì)粒。 孔15：未加樣。 結(jié)果如圖： 圖一：電泳20min時(shí)拍的。 圖二：之后又跑了5min。 問題：我們得到的條帶是目的基因還是質(zhì)粒？為什么同樣濃度質(zhì)粒，三管PCR后有的出現(xiàn)條帶，有的沒有條帶？下一步該怎么做？ 希望得到高手指點(diǎn)。 |
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- 附件 2 : PCR22014-07-29_14_時(shí)_01_分.tif
2014-07-29 21:35:29, 18.55 M
2014-07-29 21:35:54, 14.65 M
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kuaile5420
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3樓2014-07-30 20:28:43
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
merry2004120: 金幣+1 2014-07-31 23:35:33
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-01 10:31:57
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-01 10:31:57
| 嗯，加入了原質(zhì)粒，可以看出跑出來的條帶不是質(zhì)粒條帶而是PCR產(chǎn)生的條帶，但是不是目的基因的條帶：我推測(cè)由兩個(gè)原因，其一，可能是你的預(yù)變性時(shí)間（即你的第一階段）時(shí)間太短，只有兩分鐘，導(dǎo)致變性不完全，影響了后面的PCR，適當(dāng)延長(zhǎng)一下預(yù)變性的時(shí)間，eg，5min；其二，可能是引物的問題，引物設(shè)計(jì)存在問題導(dǎo)致沒有P出自己想要的目的基因，而是P出了別的基因，這個(gè)就要重新設(shè)計(jì)引物了。還有一個(gè)問題就是有些泳道根本沒有條帶：推測(cè)原因如下，可能是沒有提取到質(zhì)粒，提取之后你做鑒定了嗎？是鑒定之后跑的PCR嗎？ |
4樓2014-07-30 21:06:40
merry2004120
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