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妙語1989金蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白印跡遇到的問題，求解答 已有1人參與
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1、3，4月份的時(shí)候電泳時(shí)間一直是1.5-2小時(shí)，且跑出來的樣品壓的比較細(xì)，呈直線。7月以后電泳時(shí)間一般有3-4小時(shí)，且跑出來的樣品比較粗，一邊快一邊慢。有時(shí)電泳液變藍(lán)。電泳完后，玻片比較熱。估計(jì)電泳液溫度在50-60度之間。我的電泳液都只使用一次，配方也未變，不知道是不是溫度影響，可不可以冰浴低溫電泳。 2、我的一抗都是用碧云天的一抗稀釋液稀釋后反復(fù)使用的，有一個(gè)蛋白，一抗特異性不強(qiáng)，背景較深，但奇怪的是，第一次配的一抗背景不深，往后的越來越深。這是什么原因呢。 3、熒光淬滅，蛋白表達(dá)量較低，所以會(huì)壓的比較久一點(diǎn)，用碧云天的ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)熒光時(shí)間約為1-2小時(shí)，這次換了博士德的，壓了5分鐘就看不到Actin了。熒光淬滅的情況如何解決呢？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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妙語1989(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-08-01 10:23:05
妙語1989: 金幣+7, ★★★很有幫助, 謝謝，昨天冰浴跑電泳，跑出來的條帶好好看。再看今天的結(jié)果怎么樣了 2014-08-02 09:57:42
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1可以用冰浴低溫電泳，我以前跑電泳，夏天太熱，開著空調(diào)還不行，于是把電泳槽放到4度冷藏柜里去跑（電源之類的當(dāng)然要放外面，不然4度冷凝進(jìn)水就危險(xiǎn)了。） 2一般情況下，一抗最好不要重復(fù)使用。個(gè)人感覺，反復(fù)使用后，里面的雜質(zhì)越來越多，會(huì)形成背景的 3熒光淬滅這個(gè)比較麻煩，有條件的話，買個(gè)看膠的軟件，可以控制曝光時(shí)間。我覺得壓膠片太考驗(yàn)技術(shù)了。少加點(diǎn)ecl會(huì)發(fā)光長點(diǎn)貌似。 |
2樓2014-08-01 09:24:02
xiaomili1206
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Western Blot“淬滅”的原因主要在兩方面：含HRP的抗體和發(fā)光試劑。由于長期應(yīng)用某種發(fā)光試劑，人們多注意了抗體，不知道發(fā)光試劑其實(shí)也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成重大影響。對(duì)抗體方面來說，可以采用適當(dāng)降低抗體的濃度，發(fā)光實(shí)驗(yàn)時(shí)快速操作來解決“淬滅”的問題；對(duì)發(fā)光試劑來說，可以選用發(fā)光穩(wěn)定的發(fā)光試劑來解決“淬滅”的問題。 英格恩的ECL發(fā)光液有獨(dú)特的發(fā)光配方，發(fā)光時(shí)間長達(dá)幾小時(shí)以上，輕松進(jìn)行曝光操作。并含獨(dú)特的發(fā)光穩(wěn)定劑，4℃儲(chǔ)存1年以上，信號(hào)強(qiáng)度不變。 |
3樓2015-08-24 16:08:45
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